腦啡肽酶作為診斷心力衰竭生物學標記的研究

劉 寧，史永鋒，關一諾，趙 青，吳 迪，武軍鐸，高大松，劉 斌*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 心血管內科,吉林 長春130041；2.長春恒晨生物科技有限公司)

心力衰竭(heart failure ，HF)是一種心臟疾病的終末期臨床綜合征，可由多種心臟疾病引發(fā)。在我國，心力衰竭發(fā)病率為0.9%，患病率隨著年齡增加顯著上升[1]。心力衰竭患者的表現及病癥大多類似，但是病因往往各不相同，且大多數患者很難查到確切的病因。因此給疾病的治療帶來了很大的困難，找到一種特殊的靶向物質，針對靶向物質檢測心力衰竭是迫切需要的。

腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)也稱中性內肽酶，是一種膜結合的金屬內肽酶[2]。上世紀90年代，研究人員合成NEP抑制劑并與血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)聯(lián)合使用治療心力衰竭取得了一定進展[3]。近些年來，腦啡肽酶作為心力衰竭診斷的新靶點受到了極大的關注[4]。目前，已有相關報道證實NEP可以作為HF患者的病理生物標志物。本研究旨在研究腦啡肽穩(wěn)定性是否適合作為心力衰竭生物學標志，以及研究其在血清中含量與活性的關系。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

采用腦啡肽酶檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)(長春恒曉生物科技有限責任公司)測定血液樣本中的腦啡肽酶含量；采用腦啡肽酶活性檢測試劑盒測定血液樣本中腦啡肽酶活性。測試所用儀器為賽默飛世爾酶標儀Varioskan LUX， 美國。

1.2 研究方法

1.2.1標本采集

抽取心力衰竭患者空腹血液2 ml，于非抗凝管中。采集后的血液4℃保存，并在4 h內3 000 rpm離心10分鐘，緩慢吸出上層血清，轉入EP管中。

1.2.2檢測方法

(1)血清中NEP穩(wěn)定性研究：將30個心力衰竭患者的血清放入一個50 ml離心管中，渦旋混勻后分裝，每管200 μl。將獲得的多管混合血清分組，分別放入-80℃、-20℃和4℃中保存。以-80℃中的樣本作為對照組，測定4℃保存8 h、12 h、16 h和24 h的樣本中NEP含量。同樣，以-80℃中的樣本作為對照組，測定-20℃保存7 d、14 d、21 d和28 d的樣本中NEP含量。

(2)血清中NEP含量及酶活性相關性研究：分別用NEP含量檢測試劑盒和NEP酶活性檢測試劑盒測試40例患者血清中的NEP。通過相關性分析比對，血清中NEP含量及活性關系。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析處理。計量資料以均數±標準差(x—±s)表示，各組數據間采用t檢驗；P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中NEP的穩(wěn)定性研究

研究結果表明(表1)，分離后的血清在4℃中保存24 h之內，其性質穩(wěn)定，未見顯著下降(P>0.05)。-20℃保存的血清其保存穩(wěn)定時間較長，通過實驗結果可見(表2)，-20℃保存的血清28 d后其含量下降并不顯著(P>0.05)。

表1 4℃保存血清中NEP穩(wěn)定性(pg/ml)

表2 -20℃保存血清中NEP穩(wěn)定性(pg/ml)

2.2 血清中NEP含量及酶活性關系的研究

采用NEP濃度測量和酶活性測量試劑盒對同一批患者血清進行檢測，檢測結果進行相關性分析(圖1)，可已看出血清中NEP含量與酶活性成正相關，相關系數R2為0.7017，二者相關性較強。

圖1 血清中NEP濃度與酶活性相關性

3 討論

NEP作為膜結合蛋白，與 其他類似蛋白有著相同的性質，即可以從細胞膜表面釋放，產生保持催化活性的非膜相關形式[5]。早在30年前，科研人員就發(fā)現血清中的NEP活性與急性呼吸窘迫綜合征和心源性肺水腫相關[6]。而最近才有研究提供證據，顯示NEP在心力衰竭患者中可作為病理學生物標志替代物[7]。

有研究人員評估了1069個慢性心衰患者，患者中主要是射血分數降低的心力衰竭(HFrEF)患者[5]，通過多因素復雜分析NT-proBNP與可溶性NEP與患者的住院及死亡風險有顯著的相關性。直接比較NT-proBNP與可溶性NEP可以發(fā)現NEP在神經激素調節(jié)中的核心作用。此外，研究顯示可溶性NEP受合并癥影響較強，尤其是腎功能障礙和肥胖癥的影響[8]。而在射血分數保留的心力衰竭(HFpEF)患者中，可溶性NEP的表達量與預后并無顯著相關性。一些研究人員還發(fā)現，BNP水平高的患者血液中可溶性NEP水平也較高，但是研究人員沒有研究他們與預后的關系[9]。

以往的這些研究都預示著可溶性NEP可以作為一種診斷心力衰竭的新的生物學標記物。然而，目前各種檢驗NEP水平的實驗都需要進一步的完善和驗證。綜合先前的研究，研究報告中可溶性NEP均保存在-80℃中，但是沒有實驗人員對可溶性NEP在血清中的穩(wěn)定性進行研究。要作為可診斷的生物學標記物，需要有一定的穩(wěn)定性，本研究發(fā)現從人血清中的NEP在4℃環(huán)境中可以保存24 h，在-20℃中可以保存28 d，其穩(wěn)定性與-80℃中保存的樣本其含量無顯著差異(P>0.05)。這說明人血清中的可溶性NEP具有較好的穩(wěn)定性，基本可以滿足臨床檢測對樣本儲存和復檢的需求。

另外，還有一點值得注意的是NEP是成熟中性粒細胞的表面標記[10]，因此適當離心和樣本分離是防止不必要的膜結合NEP污染的關鍵。在適當離心之后，血清樣本原則上是非細胞的，而血漿可能含有殘留的細胞物質，會對結果分析造成混淆，因此本實驗選擇血清作為實驗樣本。

通過對之前研究總結發(fā)現，大多數研究人員選擇研究NEP在血液中的濃度來研究其對心力衰竭患者的診斷作用。而NEP作為一種酶，其在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的作用主要體現在他的酶活性強弱方面。因此了解血液樣本中NEP含量與NEP酶活性之間的關系，對其研究有一定指導性的意見。本研究通過對40例心衰患者血液樣本同時檢測NEP含量及活性，結果顯示，在人血液樣本中NEP含量及活性成正相關(r2=0.7017)，相關性較強。因此可以通過研究血液中NEP的含量來了間接顯示其酶活性強弱。

綜上所述，NEP在人血樣本中較穩(wěn)定，可以滿足臨床檢測對樣本儲存及保留復檢的要求。結合之前的研究結果，NEP有望成為心力衰竭診斷的生物學標記。只是檢測方法還需要研究人員不斷完善。