黃羽肉雞青脛性狀變化規(guī)律及遺傳分析

白 云 ，黨李蘋 ，陳 航 ，王 斌 ，王哲鵬 *

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.略陽縣畜牧獸醫(yī)總站，陜西略陽 724300）

黃羽肉雞的外貌特征對其市場銷售具有重要影響，如三黃（黃羽、黃喙和黃脛）特征通常給消費者傳遞“土雞”、“味道鮮美”、“營養(yǎng)價值高”等信息，成為消費者選購的重要標準之一[1-2]。但在黃羽肉雞的選育中總有部分個體脛色發(fā)青，給黃羽肉雞的銷售帶來不利影響。

雞的青脛表型是由真皮沉積黑色素引起，受真皮黑色素抑制基因（Id）的調(diào)控[3]。Id 位點曾被定位到Z染色體上，攜帶顯性等位基因（Id）的個體將表型為白脛或黃脛，而攜帶隱性等位基因（id+）的個體將表現(xiàn)為青脛[3-4]。Dorshorst等[3]基于關(guān)聯(lián)定位結(jié)果提出，B4GALT1（β-1,4-Galactosyltransferase 1，β-1,4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶1）可能是對應(yīng)于Id位點的候選基因，但因果突變尚未被克隆。除了Id位點外，一些調(diào)控皮膚顏色的基因也可能對青脛的外顯產(chǎn)生干擾，如雞的黃皮膚基因BCDO2（β-Carotene Dioxygenase 2，β-胡蘿卜素雙加氧脫氫酶）[5]。BCDO2是一個可將有色的類胡蘿卜素分解為無色的脫輔基類胡蘿卜素的酶。當BCDO2基因突變時會抑制類胡蘿卜素分解，引起黃皮膚表型[5]。如果選育的黃羽肉雞也攜帶BCDO2基因，則青脛表型的外顯率極有可能受飼料中核黃素、葉黃素等天然色素的干擾，給選育提純增大難度。

本研究旨在分析日齡、飼料、藥物等非遺傳因素對黃羽雞青脛表型外顯率的影響，檢測Id位點和BCDO2基因在金陵黃雞群體中的分布情況及與青脛表型的關(guān)聯(lián)性，為黃羽肉雞青脛選淘方法的建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 本研究以廣西金陵農(nóng)牧集團有限公司黃羽肉雞配套系E系花雞為研究對象，選取來自同一批次出雛的1 950只祖代雞，隨機分為全價料組、自配料組和藥物組，經(jīng)21 d飼養(yǎng)并去除死淘樣本后，其中全價料組629只、自配料組638只、藥物組632只。全價料組全期飼喂正大公司肉仔雞全價配合飼料（表1）；自配料組全期飼喂金陵公司自配料（表1）；藥物組飼喂企業(yè)自配料，并在飲水中添加1 g/kg氟爾康（氟苯尼考）全期給雞飼喂，其他飼養(yǎng)條件與全價料和自配料組保持一致。飼養(yǎng)周期為45 d，在21日齡和45日齡由同一名觀察人員記錄雛雞脛色。試驗動物均在同一棟雞舍飼養(yǎng)。

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

1.2 血樣采集與DNA提取 首先在同一黃羽肉雞群體內(nèi)，采集30只青脛和26只黃脛雞血樣。羅曼雞和尼克雞是已知的膚色與脛色被選育固定為黃皮膚的商業(yè)蛋雞品種，而略陽烏雞是青脛性狀被固定的一個地方品種。因此，本試驗采集40只羅曼雞和15只尼克雞血樣作為黃脛陽性對照，采集15只略陽烏雞血樣作為青脛陽性對照。翅下靜脈采血，ACD抗凝（ACD:血液=1:4）。ACD配方為0.48 g 檸檬酸、1.32 g 檸檬酸三鈉、1.47 g葡萄糖，用雙蒸水溶解后定容至100 mL。

基因組DNA用全血基因組提取試劑盒（TaKaRa）按說明提取。所得DNA用TE緩沖液溶解，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，用NanoDrop2000（Thermo）測定DNA濃度并將濃度調(diào)至50 ng/μL，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BCDO2基因和Id位點序列變異檢測 本研究主要對BCDO2基因C位點（BCDO2-SNP）的基因型[5]、Id位點的rs14686603（Id-SNP）及位于B4GALT1 3'UTR的1個SNP（B4G-SNP）[3]進行檢測（表2）。

SNP基因型用PCR-RFLP檢測，部分結(jié)果用Sanger測序進行驗證。PCR-RFLP檢測所用引物和內(nèi)切酶信息見表2。PCR擴增條件：94℃變性4 min，（94℃變性30 s，60℃退火25 s，72℃延伸25 s）×34循環(huán)，72℃延伸5 min。酶切體系：內(nèi)切酶0.5 μL（5 U），Buffer 1 μL，PCR 產(chǎn)物 2 μL，ddH2O 補齊至 10 μL。在37℃下用PCR儀孵育2 h，取6 μL酶切產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，電壓90 V進行電泳45 min。電泳結(jié)束后用EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄酶切結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析 日齡、飼料、藥物及候選基因序列變異與脛色的關(guān)聯(lián)性均用SAS 9.2進行卡方檢驗分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 日齡、飼料和藥物對黃羽肉雞青脛外顯率的影響如表3所示，隨著日齡增長，全價料組和自配料組黃羽肉雞的青脛比例均顯著降低（P＜0.05），但藥物組變化不顯著（P＞0.05）。在相同日齡下，不同飼料和藥物添加對青脛外顯率均有顯著影響（P＜0.05）；21日齡時藥物組青脛比例最低，45日齡時全價料組青脛比例最低，其次是自配料組。因為全價料、藥物和自配料組青脛比例在21日齡和45日齡的分布模式并不相同，因此這些結(jié)果也表明飼料、藥物和日齡對黃羽肉雞青脛外顯率的影響存在明顯的互作效應(yīng)。

表2 BCDO2及Id位點內(nèi)SNP信息

2.2 BCDO2和Id位點序列變異與青脛表型的關(guān)聯(lián)性分析 本研究用 PCR-RFLP檢測 BCDO2_SNP、Id_SNP和B4G_SNP的基因型，獲得預(yù)期大小的PCR和酶切產(chǎn)物，經(jīng)測序驗證PCR-RFLP分型結(jié)果與測序結(jié)果一致（圖1）。

BCDO2_SNP和Id_SNP位點的3種基因型在各群體中的分布無顯著差異；B4G_SNP的AA型在帶有青脛表型的黃羽肉雞和略陽烏雞中以較高的頻率出現(xiàn)，而在帶有黃脛表型的尼克和羅曼雞中并未發(fā)現(xiàn)（表4）。在黃羽肉雞品種內(nèi)，本研究并未檢測到AA與青脛表型顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

3 討 論

雞青脛表型通常被認定為一個由單基因Id控制的質(zhì)量性狀[3]，但本研究在黃羽肉雞中發(fā)現(xiàn)青脛表型不僅受非遺傳因素影響，而且個體青脛外顯程度表現(xiàn)出連續(xù)變異性，因此更符合數(shù)量性狀遺傳特點。

本研究表明，隨著日齡增長，青脛的比例在全價料組和自配料組均顯著降低，特別是全價料組使用了更多含有核黃素、葉黃素等天然色素的玉米性原料，青脛比例隨著日齡以更大幅度在減少。本研究證明了日齡、飼料和藥物等非遺傳因素對青脛外顯率的影響，并發(fā)現(xiàn)黃皮膚基因BCDO2在黃羽肉雞群體中高頻出現(xiàn)。這為非遺傳因素參加與青脛的調(diào)控奠定分子基礎(chǔ)，即飼料中的類胡蘿卜素會因為BCDO2基因的存在而在皮膚中大量沉積，影響青脛外顯率。

表3 日齡、飼料和藥物對黃羽肉雞青脛外顯率的影響

表4 BCDO2、Id及B4GALT1分型結(jié)果及基因型分布情況

在試驗早期，青脛比例最低的是藥物組，但在試驗后期藥物組的青脛比例并未像飼料組那樣隨著日齡增長逐漸降低。氟苯尼考是當今家禽養(yǎng)殖中廣泛使用的一種廣譜類抗生素，但迄今為止它與類胡蘿卜素有怎樣的直接互作關(guān)系并不清楚。但氟苯尼考可能通過以下2種間接途徑影響類胡蘿卜素沉積，進而影響雞的膚色：第一，預(yù)防性地使用氟苯尼考可以提高家禽抗病力，促進類胡蘿卜素沉積。雞感染球蟲會抑制類胡蘿卜素在皮膚中沉積，而在飼料中添加鹽霉素能明顯緩解這種抑制作用，提高血清類胡蘿卜素水平，改善脛部著色[6]。第二，氟苯尼考可能通過影響雞腸道微生物群系結(jié)構(gòu)，影響類胡蘿卜素的代謝。長期使用抗生素不僅改變雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，而且還會對免疫力產(chǎn)生長遠影響[7]。而腸道微生物在維生素的合成代謝方面發(fā)揮著重要作用，如B族維生素主要由腸道微生物合成，供宿主利用[8]。β-類胡蘿卜素作為維生素A前體，它的合成、代謝、吸收很可能受腸道微生物的影響?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，本研究推測在21日齡以前，藥物組個體預(yù)防性地使用氟苯尼考導致抗病力增強，類胡蘿卜素沉積效率提高，因此青脛比例比飼料組低，但隨著用藥時間延長，雛雞的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，對類胡蘿卜素沉積可能產(chǎn)生負面影響，造成藥物組在試驗后期的青脛比例未持續(xù)降低。

Dorshorst等[3]發(fā)現(xiàn)Id_SNP與雞青脛表型顯著關(guān)聯(lián)。但本研究在黃羽肉雞群體內(nèi)不論是對Id_SNP，還是對候選基因B4GALT1內(nèi)的B4G_SNP均未檢測到這種關(guān)聯(lián)性。由于青脛表型的因果突變尚未被克隆，Id_SNP只是一個與性狀關(guān)聯(lián)的分子標記。本研究推測，在黃羽肉雞傳代過程中，由于Id_SNP與因果突變間多次重組，這種關(guān)聯(lián)性可能消失；此外非遺傳因素可能對青脛表型的鑒定產(chǎn)生干擾，在關(guān)聯(lián)分析時引起誤差。盡管如此，這些結(jié)果并不能排除黃羽肉雞青脛表型具有遺傳基礎(chǔ)的可能性。本研究認為，黃羽肉雞的青脛表型也是由基因突變引起，之所以呈現(xiàn)出數(shù)量性狀的特征可能與修飾基因、環(huán)境間的互作有關(guān)。如果上述推測成立，則解決黃羽肉雞青脛問題的根本在于淘汰青脛基因。B4G_SNP的AA基因型只在帶有青脛表型的品種中出現(xiàn)。如果A等位基因確實與青脛基因緊密連鎖，在黃羽肉雞中未檢測到關(guān)聯(lián)是因為非遺傳因素干擾，在今后的選育工作中應(yīng)該控制環(huán)境因素，分別統(tǒng)計AA型母雞的后代青脛比例是否顯著高于GG型。這不僅有助于澄清上述推測，而且將為B4G_SNP是否可用于黃羽肉雞青脛表型的選淘提供重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究證實了黃羽肉雞青脛表型受日齡、營養(yǎng)、藥物等非遺傳因素的影響。因黃羽肉雞群體中存在黃皮膚基因，因此非遺傳因素的作用可能通過類胡蘿卜素途徑實現(xiàn)。在當前青脛表型遺傳基礎(chǔ)仍不清楚的前提下，通過營養(yǎng)調(diào)控（如在飼料中添加天然色素或加大黃玉米用量）是解決黃羽肉雞青脛問題最直接有效的措施。