2016-2018年江西省鉤端螺旋體病鼠類動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查與分離菌株鑒定

張翠彩，張汀蘭，徐建民，蔣秀高，邱海燕

鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)引起的人獸共患病，人類主要通過(guò)直接或間接接觸感染動(dòng)物的尿液而感染，宿主動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物(黑線姬鼠、黃毛鼠等)、家畜(豬、犬和牛等)，其中鼠類為鉤體病的主要宿主動(dòng)物。

21世紀(jì)以來(lái)，全國(guó)鉤體病發(fā)病率、死亡率呈逐步下降態(tài)勢(shì)，近10年已處于較低水平，但局部地區(qū)仍然有報(bào)道存在小范圍的散發(fā)或者暴發(fā)疫情[1]。江西省作為鉤體病的老疫區(qū)，每年的發(fā)病率均位居全國(guó)前列，是江西省危害較大的急性傳染病之一。2016至2018年，全國(guó)(不含港澳臺(tái)地區(qū))共報(bào)告鉤端螺旋體病病例分別為354例、201例和157例，報(bào)告發(fā)病率分別為0.0258/10萬(wàn)、0.0146/10萬(wàn)和0.0113/10萬(wàn)；而2016至2018年江西省共報(bào)告病例分別是19例、21例和9例，報(bào)告發(fā)病率分別為0.0416/10萬(wàn)、0.0261/10萬(wàn)和0.0195/10萬(wàn)，3年的報(bào)告發(fā)病率均高于全國(guó)，因此，對(duì)鉤體病的宿主動(dòng)物開展流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，了解宿主動(dòng)物種類構(gòu)成、感染狀況及分離菌株病原學(xué)特征分析有助于鉤體病的流行病學(xué)溯源及疾病的預(yù)防控制。近年來(lái)多位點(diǎn)序列分析(Multilocus sequence typing，MLST)的分子分型方法，逐漸應(yīng)用于病原菌分子分型、分子流行病學(xué)研究等。本研究于2016-2018年選擇4個(gè)江西省國(guó)家級(jí)鉤體病監(jiān)測(cè)點(diǎn)上饒縣、上高縣、上猶縣及浮梁縣作為監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)，對(duì)主要宿主動(dòng)物鼠類構(gòu)成及帶菌狀況開展流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，并對(duì)分離菌株利用暗視野顯微鏡凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清群鑒定，利用MLST 方法對(duì)其進(jìn)行基因分型研究，初步了解江西省鼠密度、帶菌率及分離菌株的血清學(xué)、分子流行病學(xué)特征，為江西省鉤體病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1捕鼠方法 選取江西省鉤體病高發(fā)的四個(gè)國(guó)家級(jí)監(jiān)測(cè)點(diǎn)上饒、上高、上猶及浮梁縣鉤體疫區(qū)稻田環(huán)境作為現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)地點(diǎn)，于2016-2018年每年4-6月、9-11月采取夾夜法開展鼠類種類構(gòu)成、鉤體病病原學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查。每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)每次放置有效鼠夾數(shù)≥300夾，行距30 m，夾距5 m，鼠夾大約為40×12×12 cm。每次天黑前放夾，次日凌晨收夾。參考《醫(yī)學(xué)動(dòng)物分類鑒定》對(duì)捕獲鼠類進(jìn)行鼠種鑒定，計(jì)算鼠密度。

1.2鉤體病原分離培養(yǎng) 無(wú)菌解剖操作，取米粒大小鼠腎組織接種到10 mL EMJH培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，采用暗視野顯微鏡觀察有無(wú)鉤體疑似菌株生長(zhǎng)。

1.3主要試劑 15群15型鉤體參考菌株診斷血清購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；基因組提取選用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司硅膠膜型TM基因組DNA提純?cè)噭┖?；PCR Premix購(gòu)自大連寶生物工程(大連)有限公司；100 bp DNA Marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.4分離菌株血清群鑒定 利用中國(guó)15群15型鉤體參考菌株免疫兔血清，采用暗視野顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT)，對(duì)分離鉤體菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，在暗視野顯微鏡下觀察凝集結(jié)果，以出現(xiàn)50%菌體凝集的血清群為最終鑒定血清群。

1.5分離菌株基因組提取 分離菌株在EMJH鉤體液態(tài)培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7～10 d，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6MLST基因分型 參考文獻(xiàn)中的MLST方案[2]，利用7個(gè)位點(diǎn)pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各位點(diǎn)詳細(xì)信息見表1，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。利用20 μL反應(yīng)體系，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Premix Ex Taq10.0 μL，純水補(bǔ)充至20 μL反應(yīng)體積。PCR 擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、雙向測(cè)序，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。將每株分離株7個(gè)位點(diǎn)序列與MLST網(wǎng)站http://pubmlst.org/上相應(yīng)等位基因進(jìn)行比較，獲得每株分離菌株的等位基因譜(gluM-pntA-sucA-tpiA-pfkB-mreA-caiB)以及ST型別。利用BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析，觀察分離菌株間的基因多態(tài)性及種群結(jié)構(gòu)。

表1 MLST分析中7個(gè)位點(diǎn)引物信息
Tab.1 Primers of seven loci in MLST analysis

位點(diǎn)引物序列 (5′ to 3′)PCR產(chǎn)物大小/bppntAF-TAGGAAARATGAAACCRGGAACR-AAGAAGCAAGATCCACAAYTAC621sucAF-TCATTCCACTTYTAGATACGATR-TCTTTTTTGAATTTTTGACG640pfkBF-CGGAGAGTTTTATAARAAGGACATR-AGAACACCCGCCGCAAAACAAT588tpiAF-TTGCAGGAAACTGGAAAATGAATR-GTTTTACRGAACCHCCGTAGAGAAT639mreAF-GGCTCGCTCTYGACGGAAAR-TCCRTAACTCATAAAMGACAAAGG719gluMF- AGGATAAGGTCGCTGTGGTAR- AGTTTTTTTCCGGAGTTTCT650caiBF-CAACTTGCGGAYATAGGAGGAGR-ATTATGTTCCCCGTGAYTCG650

2 結(jié) 果

2.1 鼠類種類構(gòu)成及帶菌監(jiān)測(cè)

2.1.1鼠種分布及分離鉤體菌株情況 2016-2018年在江西省上饒縣、上高縣、浮梁縣及上猶縣共布置鼠夾14 387只，共計(jì)捕鼠1 404只，平均鼠密度為9.76%，分離菌株64株，鼠類鉤體分離率為4.56%; 鼠種構(gòu)成包括黑線姬鼠、褐家鼠、黃毛鼠、黃胸鼠及社鼠5個(gè)種類。4個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)優(yōu)勢(shì)鼠種均以黑線姬鼠和黃毛鼠為主。從鉤體菌株分離結(jié)果顯示，浮梁縣的分離菌株來(lái)自黑線姬鼠；上饒縣和上猶縣菌株均來(lái)自黑線姬鼠和黃毛鼠，而上高縣未分離到鉤體菌株，浮梁縣的鉤體分離率高于其他2個(gè)縣，為10.56%，具體見表2。

2.1.2血清群鑒定 經(jīng)MAT試驗(yàn)結(jié)果顯示：64株江西省致病性鉤體分離株隸屬于3個(gè)血清群，分別是黃疸出血群、爪哇群和致熱群。其中黃疸出血群為江西省主要優(yōu)勢(shì)血清群，占81.25%(52/64)，其次依次為爪哇群占17.19%(11/64)和致熱群占1.56%(1/64)。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清群分布存在一定程度地域差異，浮梁和上饒地區(qū)全部為黃疸出血群，上猶地區(qū)以爪哇群為主，占84.62%(11/13)，其次為致熱群和黃疸出血群，詳見圖1。

圖1 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體菌株血清群構(gòu)成Fig.1 Numbers of Serogroup for 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi during 2016-2018

表2 2016-2018年江西省國(guó)家級(jí)鉤體病監(jiān)測(cè)點(diǎn)鼠種分布及分離菌株情況
Tab.2 Rodent distribution and strains isolated from rodent during 2016-2018 in four national monitoring sites of leptospirosis in Jiangxi

監(jiān)測(cè)點(diǎn)布夾數(shù) 捕鼠數(shù)鼠密度(%)分離菌株分離率(%)鼠種分布及分離菌株情況黑線姬鼠褐家鼠黃胸鼠黃毛鼠社鼠上饒縣2 66442515.95194.4716/2990/00/403/740/12上高縣3 8443158.19000/2140/260/200/550/0浮梁縣4 8863036.203210.5632/2530/160/110/170/6上猶縣2 99336112.06133.608/2280/00/55/1280/0合計(jì)14 38714049.76644.5656/9940/420/768/2740/18

2.2 MLST分型結(jié)果

2.2.1基因多態(tài)性分析 MLST分析結(jié)果顯示，64株致病性鉤體呈現(xiàn)6個(gè)ST型別，主要優(yōu)勢(shì)ST型別是ST1，占76.56%(49/64)，其次依次是ST143占15.62%(10/64)、ST17占3.13%(2/64)、ST92占1.56%(1/64)、ST224占1.56%(1/64)和ST216占1.56%(1/64)。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)ST型分布也存在一定程度的地域差異，上猶地區(qū)以ST143為主，浮梁和上饒地區(qū)以ST1為主，詳見圖2。

圖2 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體菌株ST型別情況Fig.2 Numbers of sequence types (STs) for 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province during 2016-2018

2.2.2BioNumerics軟件分析結(jié)果 采用UPGMA聚類分析顯示：64株菌株共分為6個(gè)Cluster群，分別對(duì)應(yīng)6種ST型，見圖3。Cluster1對(duì)應(yīng)ST216，僅包括1株2016年上猶菌株；Cluster2對(duì)應(yīng)ST92，僅包括1株2018年上猶菌株；Cluster3對(duì)應(yīng)ST17，來(lái)自2017年上饒菌株；Cluster4對(duì)應(yīng)ST224，僅包括1株2016年上猶菌株；Cluster5對(duì)應(yīng)ST1，為江西省的優(yōu)勢(shì)克隆群，包括2016-2018年17株上饒和2016、2018年32株浮梁菌株；Cluster6對(duì)應(yīng)ST143，包括10株2016年上猶菌株。由聚類圖顯示：ST型別分布地域差異明顯，上饒地區(qū)包括ST1和ST17兩種型別，浮梁僅包括ST1一種型別，上猶地區(qū)基因型別相對(duì)豐富，13株菌株呈現(xiàn)ST92、ST143、ST224和ST216四種型別，以ST143為主，占76.92%(10/13)。ST型別宿主分布存在一定程度差異。黑線姬鼠作為江西省的主要宿主，所分離菌株ST型別豐富，包括ST1、ST17、ST92、ST216和ST143五個(gè)ST型。黃毛鼠來(lái)源的分離菌株僅包括ST1、ST224和ST143三種ST型別。

圖3 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA dendrogram of 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province during 2016-2018

3 討 論

嚙齒類動(dòng)物作為鉤體病的重要宿主動(dòng)物，在鉤體病的傳播、流行中起著重要作用。江西省是鉤體病的老疫區(qū)，地理環(huán)境復(fù)雜、氣候濕潤(rùn)，嚙齒類動(dòng)物豐富。本研究選取2016-2018年4個(gè)江西省國(guó)家級(jí)監(jiān)測(cè)點(diǎn)開展現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、病原分離、鑒定研究，共捕獲5種鼠種，4個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)均以黑線姬鼠和黃毛鼠為優(yōu)勢(shì)鼠種，鼠密度為9.76%。2011年李世軍報(bào)道貴州省錦屏、黎平和榕江縣鼠密度介于5.0%～12.7%之間，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)鼠種不同，錦屏縣以黑線姬鼠為主，黎平和榕江縣以高山姬鼠為主[2]。2018年徐國(guó)英報(bào)道福建省鼠密度為6.29%，優(yōu)勢(shì)鼠種以黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠和針毛鼠為主[3]。由此可見，不同省份的鼠密度稍有差異，并且優(yōu)勢(shì)鼠種也略有不同。本次江西省現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的鼠腎分離率偏低，為4.56%。巴西、新喀里多尼亞及馬來(lái)西亞有文獻(xiàn)報(bào)道鼠類鉤體分離率介于11.0%～80.3%之間[4-6]。本團(tuán)隊(duì)對(duì)2002-2014年江西省鉤體病開展流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示鉤體分離率為9.35%[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道福建、安徽及浙江地區(qū)鉤體分離率分別為0.76%、4.75%及1.61%[8-10]。由于鉤體的分離培養(yǎng)技術(shù)要求較高，要求鉤體液態(tài)培養(yǎng)基放置28 ℃孵箱內(nèi)培育，每隔5～7 d檢查有無(wú)鉤端螺旋體生長(zhǎng)。若有生長(zhǎng)，即為分離陽(yáng)性。若未見生長(zhǎng)，需繼續(xù)培養(yǎng)到60 d，仍不見鉤端螺旋體方作陰性處理。因此，鉤體的培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，采用的是液態(tài)培養(yǎng)基，而且頻繁鏡檢容易受到污染，故其檢出率較低。

本團(tuán)隊(duì)對(duì)2002-2014年間江西省分離菌株進(jìn)行血清群和MLST分析，結(jié)果顯示黃疸出血群、爪哇群和澳洲群為優(yōu)勢(shì)血清群，MLST分型結(jié)果顯示ST1、ST143、ST105、ST37和ST17為5個(gè)優(yōu)勢(shì)ST型別[7]。徐建民等利用PFGE分型技術(shù)對(duì)2002-2008年江西監(jiān)測(cè)菌株研究發(fā)現(xiàn)：黃疸出血群賴型、澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型是江西省人群及宿主動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)型別[11]。本次研究顯示黃疸出血群和ST1為2016-2018年江西鼠類的優(yōu)勢(shì)型別，血清群和ST型別分布在江西省地域差異明顯，這可能與不同地區(qū)的地理位置、地形地貌、天氣、海拔等因素有關(guān)。據(jù)報(bào)道根據(jù)地理位置和地形地貌等特征，江西省分為5個(gè)不同的動(dòng)物鉤體病地理流行病區(qū)域[7]。本次研究中分離到鉤體菌株的3個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，隸屬于其中的2個(gè)不同地理流行病區(qū)域，浮梁和上饒?zhí)幱诮鳀|北部丘陵地帶，平均海拔在100～300 m左右；而上猶處于江西省西南部高原地區(qū)，森林植被豐富，適宜嚙齒類動(dòng)物生存，平均海拔在1 000～1 600 m左右。本次研究中2016-2018年江西省鉤體病優(yōu)勢(shì)流行型別，與本團(tuán)隊(duì)對(duì)2002-2014年江西調(diào)查及徐建民等對(duì)2002-2008年的江西調(diào)查結(jié)果一致，這提示近年來(lái)江西省鉤體病主要流行血清群和ST型別變化不大。李世軍等對(duì)2007-2009年貴州菌株研究發(fā)現(xiàn)：3株分離株鑒定為黃疸出血群和ST1型別[12-13]。王亞琳等報(bào)道2010年四川樂至人間鉤體疫情主要致病血清群為是黃疸出血群[1]。綜上所述，江西省鉤體病主要流行型別與中國(guó)四川、貴州等其他地區(qū)型別一致。

嚙齒類動(dòng)物以及家畜是鉤體病的主要宿主動(dòng)物，江西省是鉤體病老疫區(qū)，本次江西省鼠類鉤體病現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查工作為江西省鉤體病的分子流行病學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。因此，在以后的工作中應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)嚙齒類動(dòng)物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解鉤體病疫區(qū)的鼠種構(gòu)成、鼠密度、帶菌率及人間、宿主動(dòng)物的感染型別，為江西省鉤體病的流行病學(xué)溯源以及疾病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)