中藥現(xiàn)場鑒定技術研究進展

胡曉宇，楊馨玥，姚金劍，陳雪，都景曉，辛杰，張波，陳敏

(臨沂大學藥學院,山東 臨沂 276000)

近年來，國家高度重視中醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展，中醫(yī)藥事業(yè)迎來了“天時、地利、人和”的最好發(fā)展機遇，中醫(yī)藥產業(yè)總值屢創(chuàng)新高。中藥材是中醫(yī)藥產業(yè)立足和發(fā)展的物質基礎，藥材的真實性和優(yōu)良品質是保障中藥產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的根基。中藥鑒定的核心任務即是鑒定中藥的“真?zhèn)蝺?yōu)劣”，因此中藥鑒定在整個中藥產業(yè)的生產、銷售及開發(fā)利用過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

近20年，隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展及多學科的交叉融合，中藥鑒定技術也進入了快速發(fā)展時期，鑒定手段不斷豐富，鑒定結果的客觀性和準確性也不斷提高。陳士林等[1]總結分析了中藥鑒定新技術的原理、特點及發(fā)展方向，包括顯微鑒定新技術、光譜鑒定、色譜鑒定、分子鑒定、生物效益鑒定等等。中藥材的生產及流通是整個中藥產業(yè)的最前端，也是最需要中藥鑒定技術的環(huán)節(jié)。然而現(xiàn)有中藥鑒定技術大多只停留在實驗室研究階段，在藥材生產實際、貿易流通環(huán)節(jié)的現(xiàn)場化應用不足，即缺乏中藥現(xiàn)場鑒定技術。

中藥現(xiàn)場鑒定技術，即適用于中藥種植基地的田間地頭、中藥流通領域的藥材市場和藥店等場所的中藥鑒定技術的總稱。根據其應用對象及目的不同，大致可以分為兩個層次：一是藥材監(jiān)督檢測部門，對檢測結果準確性和客觀性要求較高，且有條件攜帶部分簡單的車載儀器供現(xiàn)場鑒定使用的鑒定技術；二是藥材生產及消費者，對檢測結果要求直觀可見，容易判斷，檢測過程簡便高效，且基本不依賴任何儀器設備的鑒定方法。因此，對于中藥現(xiàn)場鑒定技術而言，其技術特點要求：①不依賴儀器設備，或僅需要少量小型便攜式儀器；②檢測結果越直觀越好；③檢測時間短，盡量控制在1 h以內；④操作簡單，簡便易學；⑤盡量減少有毒試劑或有機試劑的用量；⑥檢測成本低。

鑒于目前尚沒有專門針對中藥現(xiàn)場鑒定技術的概述且以現(xiàn)場鑒定為出發(fā)點的鑒定研究較少，為充分發(fā)揮中藥鑒定技術在生產及貿易實踐中鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的重要作用，作者篩選了可用于現(xiàn)場鑒定的技術方法，介紹了方法的可行性、適用范圍及優(yōu)缺點，亦為中藥現(xiàn)場鑒定技術的研究開發(fā)提供參考。

1 經驗鑒別

經驗鑒別主要是指鑒定人憑借對中藥材的眼觀、口嘗、鼻聞、手摸等多種感覺并結合“水試”、“火試”或其他“試劑反應”產生的特殊實驗現(xiàn)象，給予藥材直觀的評價，辨別藥材真?zhèn)?。經驗鑒別在中藥房及藥庫等場所應用極其廣泛，且十分高效。陸麗元[2]介紹了經驗鑒別法在基層中藥庫中的主要應用，總結了不同藥材通過眼觀、口嘗、鼻聞、手摸、水試、火試等手段達到真?zhèn)舞b別的具體方法。經驗鑒別具體又可分為性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別等部分。

1.1 性狀鑒別 性狀鑒別是傳統(tǒng)四大鑒定技術之一，在中藥鑒定技術匱乏的時期發(fā)揮著重要作用。時至今日，性狀鑒定仍然是生產實際應用最廣泛的鑒定技術，尤其是在條件有限的基層。性狀鑒別多用于性狀沒有發(fā)生較大變化的藥材，如生藥和中藥飲片。王文驪[3]詳細介紹了酸棗仁、黃精、沒藥、附子、金錢草等10余種正品中藥材及其常用偽品的性狀差異，用以鑒別真?zhèn)?，確保臨床用藥安全有效。性狀鑒別是最基本也是十分高級的鑒定技術之一?！白罨尽痹谟诙鄶?shù)鑒定人根據藥材的性狀描述即可進行簡單的初判，而“高級”之處在于如今能夠真正熟練或是精通此項技術的人才實屬鳳毛麟角，且要練就一番“火眼金睛”需要大量的實踐與積累。性狀鑒別應用于現(xiàn)場鑒定的優(yōu)勢包括：無須儀器設備、鑒定快速、不損壞藥材、方法適用性較廣、可辨真?zhèn)我嗫膳袃?yōu)劣等等。其局限性在于鑒定結果受鑒定人主觀因素影響較大，中藥種類浩繁導致鑒定人能力有限，且人才短缺嚴重。

1.2 顯微鑒別 中藥顯微鑒定技術主要是指利用各種顯微鏡對中藥的組織、細胞及細胞內含物的形態(tài)特征進行觀察分析，用以評價中藥質量的方法。顯微鑒定適用性較廣，尤其是對于缺乏性狀鑒別依據的中藥材及中成藥粉末。中藥顯微鑒定技術應用于現(xiàn)場化的主要優(yōu)勢在于所需儀器設備簡單(光學顯微鏡可用放大鏡代替；粉碎機亦可用手持式研磨裝置代替)、速度快、取樣量少、實用且環(huán)保。王珺等[4]詳細介紹了中藥顯微鑒別技術的發(fā)展歷史及其在中藥組織鑒別、粉末鑒別、顯微定量等方面的應用。

1.3 理化鑒別 理化鑒別主要包括水試法、火試法和部分“顯色反應”，水試法是根據某些中藥材在水中或遇水后產生明顯而特殊的反應，用以鑒別藥材；火試法是指通過觀察中藥材經火燃燒或烘焙后產生的氣味、顏色、煙霧、聲響、膨脹、熔融及燃燒程度等變化現(xiàn)象，以鑒別藥材的方法。王裴芳等[5]采用水試法用以鑒別西紅花摻偽紅花、菟絲子參雜質、乳香摻雜人工偽品；利用火試法鑒別海金沙、檀香、蘇木、血余炭、青黛、降香等藥材摻雜偽品，效果良好。王秀珠[6]以特殊顯色反應為主要鑒別手段，概況總結了35種有毒中藥的理化鑒別方法，如“川烏乙醇提取物，加醋酸溶解后遇碘化汞鉀顯黃色沉淀；山豆根外皮遇氫氧化鈉顏色由橙紅變血紅，經久不退”等等。理化鑒別操作簡單且對于檢測條件無要求，是中藥現(xiàn)場鑒定的有效方法。

2 薄層色譜及其聯(lián)用技術

薄層色譜(TLC)是一種較早應用于中藥鑒定的方法，在我國歷版藥典中均有大量應用。TLC以中藥化學對照品、對照藥材或其提取物為參照，進行特定的顯色反應來進行藥材的真?zhèn)舞b定[7]。TLC操作簡便、檢測時間短、色譜結果直觀、檢測成本低廉、無須昂貴實驗儀器等技術特點均符合中藥現(xiàn)場鑒定技術的要求。TLC僅需配以小型提取裝置及手持式紫外燈即可現(xiàn)場運用。TLC適用性廣，對于動植物、礦物藥材、中藥提取物、中成藥等均可使用，但TLC僅可進行藥材真?zhèn)舞b定，缺乏品質優(yōu)劣的鑒定能力，且需要對照品或對照藥材，對未知藥材無法鑒定。TLC在中藥現(xiàn)場鑒定技術開發(fā)中具有一定的優(yōu)勢，如若針對不同藥物開發(fā)出相應的檢測試劑盒將會進一步提高TLC的現(xiàn)場化應用。

TLC用于中藥鑒定仍需要對照品或對照藥材，為解決這一問題，可將TLC與其他定性鑒別儀器聯(lián)用，從而實現(xiàn)中藥的真?zhèn)舞b定。陳艷瓊等[8]將TLC與表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)聯(lián)用實現(xiàn)了中藥黃連的快速鑒別，其首先分別掃描了鹽酸小檗堿對照品的常規(guī)拉曼光譜(Raman spectroscopy，RS)、黃連TLC小檗堿斑點的RS及其SERS，然后將黃連TLC斑點的SERS與鹽酸小檗堿對照品的RS進行對比分析。最終，通過扣除空白對照后，TLC中小檗堿成分的SERS與對照品的RS的光譜特征一致。因此，黃連的鑒別可直接將其SERS與小檗堿對照RS進行比對，而不再需要小檗堿對照品，從而實現(xiàn)了黃連的無標化快速檢測。

3 光譜鑒別技術

近年來，光譜鑒別技術如近紅外光譜(near infrared reflectance spectroscopy，NIR)、RS在中藥鑒定中的應用逐漸增多。光譜鑒別的主要優(yōu)勢在于簡便高效、快速無損。尤其是便攜式近紅外光譜儀和便攜式拉曼光譜儀的研發(fā)應用，為NIR和RS技術應用于中藥現(xiàn)場化鑒定提供了強有力的工具。

3.1 NIR NIR是指介于中紅外光譜與可見光之間的電磁波，其譜區(qū)范圍為780～2 526 nm之間。NIR運用于中藥現(xiàn)場鑒定的主要方式是通過便攜式近紅外光譜儀對藥材進行掃描并收集信號，然后通過主成分分析法、簇類獨立軟模式法、支持向量機法、偏最小二乘判別分析等不同算法進行信號處理，從而實現(xiàn)藥材的鑒別。江明珠等[9]利用便攜式近紅外光譜儀對霍山石斛楓斗和河南石斛楓斗進行光譜采集，采用一階導數(shù)+標準正態(tài)變量變換+均值中心化的信號預處理方法，然后運用偏最小二乘判別分析建立了快速無損鑒別石斛的數(shù)理模型，實現(xiàn)了231個石斛楓斗的快速無損鑒別且正確率100%。NIR適用于中藥品種鑒別、產地鑒別以及中藥質量評價等。

3.2 RS RS是一種散射光譜，其定性定量分析是基于拉曼效應原理。便攜式拉曼光譜儀是針對大型拉曼儀的激光器、探頭及光譜儀等部位進行小型化設計，從而使其在保證分辨率和靈敏度的同時兼具體小質輕、便于攜帶的優(yōu)點。RS適用于中藥材的鑒別、中藥成分分析及中藥質量控制。黃秀麗等[10]利用便攜式激光拉曼光譜儀對靈芝孢子油和其他5種植物油進行光譜掃描，然后依據圖譜1 115 cm-1峰強度大于350和1 300 cm-1/1 262 cm-1峰強度比值及峰面積比值均大于2的特征，建立了現(xiàn)場化靈芝孢子油摻偽的快速鑒別方法。

4 分子鑒定

中藥分子鑒定是中藥學與分子生物學的有機結合，通過20多年的發(fā)展，如今已然成為中藥鑒定領域的焦點，且獲得了多項重要成果，如《中國藥典》2010年版首次收錄了特定引物PCR標記技術鑒定蘄蛇和烏梢蛇，《中國藥典》2015年版收載了DNA條形碼技術指導原則、誕生并發(fā)展了一門新興學科——《分子生藥學》等等[11-12]。中藥分子鑒定以中藥遺傳物質的差異性來進行鑒別，不受藥材外觀性狀的影響，樣品用量少，檢測結果準確。該技術對于能夠提取到足量DNA的中藥均可使用，在多基源藥用動植物鑒定、瀕危珍貴動植物藥材鑒定、藥材摻偽鑒定、含生藥原形的中成藥鑒定、藥材生長年限鑒定、產地鑒定等方面具有十分突出的技術優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng)鑒別中的諸多難點問題[13]。

中藥分子鑒定傳統(tǒng)方法通常先利用CTAB法或SDS法提取藥材DNA，然后利用PCR儀進行擴增及凝膠成像檢測或進行基因測序。整個鑒定過程步驟煩瑣、耗時長，且對儀器、實驗條件、操作人員技術水平均有較高要求，導致無法應用于現(xiàn)場快速檢測。為解決以上問題，袁媛等[14]通過技術創(chuàng)新與模式創(chuàng)新建立了中藥材分子鑒別現(xiàn)場運用策略。其首先建立了一種基于堿裂解法的中藥材DNA快速提取方法，并成功開發(fā)了試劑盒，極大程度的縮短了DNA提取時間，簡化了操作流程，且提取效果良好(果實、種子、全草、花類、皮類、根類藥材及炮制品，DNA提取成功率在85%以上)；其次以金銀花為例，改良了一種基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記的LAMP技術，通過在反應底物中加入SYBR Green染料，紫外燈下檢測有無熒光即可鑒定藥材真?zhèn)巍?/p>

按照整個規(guī)程操作，實現(xiàn)藥材的現(xiàn)場鑒定時間可控制在1 h以內，過程中僅需要手持式研磨儀、微型金屬加熱槽、手持式紫外燈等簡單裝置，且操作簡便易行、檢測成本低。此套鑒定技術體系為中藥分子鑒定的現(xiàn)場運用提供了有力借鑒，且比較適用于藥監(jiān)部門的飛行檢測。

5 免疫層析技術

免疫層析技術是將基于抗原與抗體特異性免疫反應與紙色譜技術原理相結合的一種定性定量檢測技術。其以纖維層析材料為固定相，在毛細作用下將樣品中的待檢測物質遷移至抗原或抗體固定區(qū)域，然后通過不同標記物的顯色反應進行結果判定。其適用于現(xiàn)場化檢測的最主要的優(yōu)勢在于檢測結果比較直觀，不需要或僅需一至兩個小型儀器，且檢測時間短(通常在10 min以內)。根據標記物的不同，現(xiàn)有已應用于中藥免疫層析鑒定中的免疫層析技術主要包括膠體金免疫層析技術(colloidal gold immunochromatograohic assay，GICA)和熒光標記免疫層析技術(fluorescent immunochromatographic assay，F(xiàn)ICA)。

5.1 膠體金免疫層析技術鑒定 GICA是以膠體金顆粒為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種新型固相免疫標記技術。該技術自1990年誕生至今，已在醫(yī)學檢驗、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域廣泛應用，直至近10年才被中藥學者應用于中藥鑒定研究領域，涉及中藥質量評價、中藥安全性評價等[15-17]。膠體金是一種自帶紅色的金顆粒，其檢測結果直觀可見，無須儀器設備，再者GICA檢測時間通常不超過10 min，操作亦十分簡單，因此GICA非常適用于現(xiàn)場檢測。此外，由于GICA是基于抗原與抗體的特異性識別而實現(xiàn)的定性檢測，因此具有較高的方法特異性，且靈敏度較高，通常在pg-ng級別。

GICA可實現(xiàn)中藥指標性成分的半定量檢測，因此其主要用于中藥質量的優(yōu)劣評價(以顏色深淺鑒別)或基于藥典標準的中藥質量合格性評價(以顏色有無鑒別)。

甘草酸是《中國藥典》中規(guī)定的甘草指標性成分之一，Zhao等[18]建立了甘草酸的GICA檢測方法，該試紙靈敏度為20～50 ng·mL-1，檢測時間為10 min，通過自來水浸提不同甘草組織部位30 min后，該試紙可有效鑒別甘草根、莖、葉中甘草酸含量高低。南鐵貴等[19]以特異性識別人參皂苷Re的單克隆抗體為原料，建立了人參皂苷Re的GICA檢測方法(檢測限為200 ng·mL-1)，通過自來水浸提人參樣品30 min，上清用GICA試紙檢測，10 min即可鑒別不同年限人參藥材中人參皂苷Re的含量多寡，可作為人參質量優(yōu)劣評價的重要依據。整個檢測過程均不需要儀器設備，且檢測時間短，操作簡便，完全適用于現(xiàn)場化操作。

張波等[20]以《中國藥典》規(guī)定的金銀花指標性成分綠原酸和木犀草苷為研究對象，制備了兩者的特異性單克隆抗體，通過膠體金標記抗體后分別制備了檢測綠原酸和木犀草苷的膠體金免疫檢測試紙，按照藥典標準方法提取綠原酸和木犀草苷，根據藥典中兩者的含量限定要求分別稀釋至相應倍數(shù)后，以試紙條檢測，通過試紙條檢測線的顏色有無即可鑒定樣品中綠原酸和木犀草苷含量是否滿足藥典要求，從而實現(xiàn)了金銀花指標性成分含量合格性的快速測定，整個從提取到檢測的過程不超過1 h，且過程中僅用到了超聲清洗儀一臺儀器。

此外，現(xiàn)已有柚皮苷[21]、柴胡皂苷D[22]、番瀉苷A和番瀉苷B[23]、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1[24]、桑皮苷A[25]、積雪草苷[26]、淫羊藿苷[27]等多種中藥質量控制指標性成分的膠體金快速檢測試紙研制成功，為這些中藥材的質量現(xiàn)場化評價提供了有力工具。

GICA在中藥真?zhèn)舞b定方面的應用較少，其主要原因在于可直接用于區(qū)別藥材的指標性成分極少。中藥種類浩繁，且同科屬多種藥用植物均可入藥，在化學成分層面上很難找出某個藥材特有而其他藥材沒有的專屬性物質，此外該物質還需有一定的含量以便于提取檢測。尋找和發(fā)現(xiàn)此類中藥真?zhèn)舞b定指標性成分，再結合現(xiàn)有的質量評價指標性成分，即可利用GICA技術建立藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣同步鑒定的現(xiàn)場化檢測方法。例如，土大黃苷是偽品大黃區(qū)別于正品大黃的真?zhèn)舞b定指標性成分，同時蒽醌類成分是大黃的質量評價指標性成分，因此，通過建立檢測兩類成分的GICA檢測方法，并簡化提取工藝，即可建立大黃的真?zhèn)蝺?yōu)劣同步快速、現(xiàn)場化鑒定方法，從而便于大黃質量的現(xiàn)場化檢測，便利大黃貿易交流。

5.2 熒光標記免疫層析技術 除以膠體金為標記物的免疫層析技術以外，熒光標記物如熒光微球和量子點等也廣泛應用于免疫層析試紙[28]，但與膠體金試紙相比，熒光標記物需要紫外燈檢測結果且熒光強度衰減較快，穩(wěn)定性及便利性略差。Qu等[29]利用量子點標記了可特異性識別葛根素的單克隆抗體，并制備了免疫層析試紙，通過試紙條閱讀器實現(xiàn)了葛根素的定量檢測，其檢測范圍為1～10 μg·mL-1。同理，Zhang等[30]將量子點標記于特異性識別大黃酸的雞卵黃抗體上，并制備了免疫層析試紙，該試紙靈敏度為98.2 ng·mL-1。

6 適配體層析技術

核酸適配體(aptamer)是一種通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選獲得的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA)，其能夠折疊成一定的空間結構與靶標物質特異性吸附。適配體功能與抗體相似，但由于其可通過動物體外化學合成，又被稱為“化學抗體”。此外，適配體還具有分子量小、易于標記、穩(wěn)定性好、無批間差異等優(yōu)勢，目前已廣泛應用于臨床醫(yī)療、生化分析、食品安全等領域[31-33]。適配體層析技術原理與免疫層析技術相似，僅是以適配體取代了免疫層析中抗體的作用，該技術適用于中藥現(xiàn)場鑒定的原理與優(yōu)勢亦與免疫層析相同。目前適配體層析技術主要用于中藥安全性評價研究，如Zhou等[34]篩選了赭曲霉毒素的適配體，并以膠體金為標記物制備了適配體層析試紙，將其應用于中藥黃芪的赭曲霉毒素現(xiàn)場快速篩查，檢測結果與液質聯(lián)用檢測結果相同。雖然目前針對中藥指標性成分的適配體層析試紙研究還鮮有報道，但其自身的諸多優(yōu)勢表明其在中藥現(xiàn)場鑒定方面具有較廣闊的發(fā)展前景。

7 總結與展望

中藥現(xiàn)場鑒定技術是中藥鑒定技術在生產實際和中藥流通領域的現(xiàn)場化運用，是實現(xiàn)中藥鑒定技術成果轉化的主要方向之一，中藥鑒定技術現(xiàn)場化運用以后亦將大大推動中藥產業(yè)的發(fā)展。

現(xiàn)有中藥現(xiàn)場鑒定技術如經驗鑒別、薄層色譜鑒別、近紅外和拉曼光譜鑒別、分子鑒定在中藥真?zhèn)舞b定應用較多，且技術優(yōu)勢較明顯，未來應進一步針對現(xiàn)場化應用的目標加強技術優(yōu)化和技術適用范圍的擴大。而針對中藥品質優(yōu)劣的現(xiàn)場鑒定技術(如免疫層析技術、適配體層析技術)雖然在檢測環(huán)節(jié)可以做到簡單快速，但在中藥指標性成分的快速提取方面還有待更深入的研究，諸多難題仍需克服，包括：①如何改進提取方式？藥典中的指標性成分提取方式以超聲提取和加熱回流提取為主，且部分藥材還需要提前浸漬或萃取或酸水解處理，提取時間往往在30 min至3 h之間，如何縮短提取時間，簡化步驟，且保證提取效率?近年來發(fā)展的閃士提取和酶輔助提取方法可供參考。②如何標準化？提取方法和檢測方法改變以后，需要制定一套適用于現(xiàn)場化應用的提取、檢測、評價的標準體系以便于與《中國藥典》中的標準實現(xiàn)等效。