制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關(guān)性研究

羅 曉袁立霞張文麗鐘為章蔣永豐張 迎徐東升

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制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關(guān)性研究

羅 曉1,2,袁立霞2,張文麗2,鐘為章1*,蔣永豐2,張 迎2,徐東升2

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018；2.河北科技大學(xué)建筑工程學(xué)院,河北 石家莊 050018)

以2座制藥廢水廠的生物曝氣階段為例,結(jié)合Miseq測(cè)序分析技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)研究活性污泥中微生物群落和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因的分布特征、擴(kuò)增情況及其相關(guān)性. 結(jié)果表明:β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因OXA-1、OXA-2和OXA-10在2個(gè)水廠(J廠和K廠)中均能被檢出,OXA型基因豐度在K廠中為5.82×105~3.94×107copies/g(干重),在J廠的豐度范圍為4.84×107~1.09×1010copies/g,3種基因豐度在曝氣處理中顯著擴(kuò)增. Miseq測(cè)序結(jié)果表明:K廠中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria,Planctomycetes,Bacteroidetes,Chloroflexi和Acidobacteria等,總平均相對(duì)豐度比例為82.13%;J廠中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes和Thermi,總平均相對(duì)豐度比例為85.76%.冗余分析顯示:生物群落中、和等菌屬可能是OXA-1、OXA-2和OXA-10的主要攜帶菌屬;、和e可能是OXA-1的主要攜帶菌屬,、和可能是OXA-10的主要攜帶菌屬.

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因；熒光定量PCR；Miseq；微生物群落結(jié)構(gòu)

近些年,抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)和抗生素抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria,ARBs)被認(rèn)為可能成為一種新型的環(huán)境污染物,其風(fēng)險(xiǎn)比抗生素藥物本身的污染風(fēng)險(xiǎn)更高[1],關(guān)于其行為特點(diǎn)和傳播途徑的研究也日益增加.抗生素抗性細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性機(jī)理包括:細(xì)菌外膜不滲透性障礙、細(xì)菌外排泵系統(tǒng)、抗生素作用的靶位變化和抗生素的鈍化失活等[2].抗性基因是抗性菌具有抗性的主要原因之一,它可以通過(guò)多種形式的可移動(dòng)遺傳元件如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列等,突破細(xì)菌的種屬關(guān)系廣泛傳播,加重抗性污染[3].并且碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌患病率上升迅速[4],這將對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[5-6].

熒光定量PCR技術(shù)為研究環(huán)境中抗性基因和抗性微生物分布特征提供了有力的手段[7].已有研究表明制藥廢水處理系統(tǒng)的進(jìn)水中往往含有高濃度的抗生素及生產(chǎn)原料和中間體[8],對(duì)生物處理單元的微生物群落形成高強(qiáng)度選擇性壓力,為ARGs在污水中的持久存在和傳播擴(kuò)散提供了有利條件,并且制藥廢水處理系統(tǒng)的出水中ARGs的濃度高于市政污水處理系統(tǒng)的出水[9-10].已有研究表明β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因廣泛存在于河流[11]和污水廠中[12],例如TEM-1廣泛存在于醫(yī)療廢水[13],污水廠[12],河流中[5].Yang等[14]發(fā)現(xiàn)在不動(dòng)桿菌()中檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類(lèi)OXA型抗性基因.Zhang等[15]對(duì)東亞以及北美的15家污水處理廠的水質(zhì)進(jìn)行了調(diào)研,檢測(cè)出了多種β-內(nèi)酰胺抗性基因如OXA-1、OXA-2、OXA-10、AmpC和TAM-1.Wang等[16]發(fā)現(xiàn)OXA-1和OXA-10型抗性基因廣泛存在于以CASS, MBR, EAAS, CAS, A2O等為主要處理工藝的制藥廢水處理廠,且檢出頻率為100%.抗生素廢水有機(jī)物濃度較高,成分復(fù)雜,難于處理,目前主要關(guān)注的是抗生素和相應(yīng)抗性基因的相關(guān)性研究,缺乏抗性基因在降解過(guò)程中微生物群落和其相關(guān)性分析的深入研究.

本文選取兩座制藥廢水處理廠中生物曝氣階段為研究對(duì)象,利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù),解析制藥廢水廠生物曝氣階段活性污泥中β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因和微生物群落結(jié)構(gòu)在生物曝氣處理過(guò)程中的分布規(guī)律,并確定活性污泥中土著β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因和微生物特定菌屬的相關(guān)性,以期為評(píng)估廢水處理廠抗性基因和抗性菌環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù),并制定有效的控制ARGs和ARBs的傳播策略.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

河北省某頭孢類(lèi)制藥廢水處理站(K廠),該廠設(shè)計(jì)水量500m3/d,主要采用活性污泥法處理頭孢類(lèi)生產(chǎn)廢水,污水處理流程為:調(diào)節(jié)池-一級(jí)曝氣池-初沉池-二級(jí)曝氣池-二沉池.樣品采用500mL聚乙烯瓶,于2017年10月,采集不同污水處理單元活性污泥樣品,分別標(biāo)記為G(調(diào)節(jié)池)、D(一級(jí)曝氣池)、B(初沉池)、A(二級(jí)曝氣池)、C(二沉池);河北省某制藥廠(J廠),該廠設(shè)計(jì)水量300m3/d,用500mL聚乙烯瓶,于2018年1月,采集曝氣池(HB)和沉淀池(HC)中活性污泥.取樣結(jié)束后,于冰盒中運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室,離心(5min,11000r/min)后稱(chēng)取5g冷凍于-80℃冰箱中,以備DNA提取.具體樣品編號(hào)及采樣信息見(jiàn)表1.

表1 兩制藥廢水廠樣品和相關(guān)水質(zhì)信息

1.2 水樣分析

按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[17]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分析常規(guī)化學(xué)指標(biāo),測(cè)定水中CODcr和氨氮,測(cè)定均有3個(gè)平行,最后計(jì)算平均值.

1.3 DNA提取及PCR的擴(kuò)增

DNA提取采用PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒,按照試劑盒流程提取DNA.以所提取各樣品DNA為模板,對(duì)其16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)體系為30μL,上游引物為520F(5'-AYTGGGYD- TAAAGNG-3'),下游引物802R(5'-TACNVGGGTA- TCTAATCC-3').PCR擴(kuò)增管中添加DNA模板0.5μL,正反向引物各0.6μL,滅菌水22.4μL,dNTP2.4μL,3μL緩沖液,ExTap酶0.5μL.PCR反應(yīng)程序:先94℃預(yù)變性10min,然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min),最后72℃延伸10min.

擴(kuò)增結(jié)束后,運(yùn)用1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收DNA.PCR擴(kuò)增后的條帶亮度明顯,位置清晰,可直接用于后續(xù)測(cè)序分析.委托北京理化分析測(cè)試中心進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序.

1.4 抗性基因的定性檢測(cè)

采用PCR方法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10,所用引物見(jiàn)表2.

抗性基因定性檢測(cè)反應(yīng)體系為:10μL Green qPCR Master Mix,0.5μL引物(F),0.5μL引物(R),DNA模板1μL,加滅菌水至20μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 5min,并在4℃下保存.每次運(yùn)行使用無(wú)菌水做陰性對(duì)照,PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂凝膠電泳分析.

表2 抗性基因所用的引物序列(參考文獻(xiàn)[18])

1.5 抗性基因的定量檢測(cè)

采用SYBR-Green 實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)各基因進(jìn)行定量分析,檢測(cè)儀器為StepOne型熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó)).PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序確認(rèn)后,使用生工質(zhì)粒提取試劑盒SK1131從陽(yáng)性克隆子中提取質(zhì)粒,用作標(biāo)準(zhǔn)曲線.使用NanoDrop微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific,美國(guó))測(cè)定質(zhì)粒濃度.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)按照10倍梯度濃度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒,于90μL稀釋液中加入10μL質(zhì)粒,做4~6個(gè)點(diǎn),通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取合適標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、環(huán)境樣品、陰性對(duì)照均做3個(gè)平行,取平均值進(jìn)行計(jì)算.

質(zhì)?？截悢?shù)換算公式

=[×10-9×6.02×1023]/[×660] (1)

式中:為質(zhì)?？截悢?shù),copies/μL;為質(zhì)粒濃度, ng/μL;為克隆產(chǎn)物堿基數(shù),g/mol.

熒光定量PCR反應(yīng)體系為:12.5μL 2×SYBR, 1.0μL DNA(10ng/μL),0.5μL引物F (10mol/L), 0.5μL引物R(10mol/L),10.5μL水,總體積25.0μL.熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?①50℃, 2min;②95℃,5min;③95℃, 20s;④退火,30s;⑤72℃, 31s;⑥Plate read,重復(fù)③~⑤,重復(fù)39次;⑦M(jìn)elt-curve分析60~95℃.每隔0.2℃采集1次熒光以生成溶解曲線,根據(jù)溶解曲線變化檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果的特異性.退火溫度和反應(yīng)時(shí)間根據(jù)引物不同進(jìn)行調(diào)整.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

抗性基因濃度結(jié)果和群落結(jié)構(gòu)使用OriginPro 8.6軟件(Origin Lab Corporation,USA)進(jìn)行分析;使用MOTHUR軟件計(jì)算各個(gè)樣本Alpha多樣性指標(biāo),以反映本次測(cè)序深度、物種均勻性等;使用R軟件對(duì)樣本繪制熱圖并分析;ARGs與群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性使用CANOCO 5.0(Microcomputer Power,Ithaca,NY)軟件分析.

2 結(jié)果討論與分析

2.1 微生物菌群耐藥基因定量檢測(cè)

利用熒光定量PCR的方法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10在2廠中的分布特征和變化情況,結(jié)果如圖1所示.

圖1 水處理階段ARGs分布

由圖1可見(jiàn),在K廠中,OXA型基因的豐度范圍為5.82×105~3.94×107(單位copies/g,含水率96.32%);J廠中,OXA型基因的豐度范圍為4.84×107~1.09× 1010,J廠比K廠的豐度高出2個(gè)數(shù)量級(jí);且2廠中ARGs豐度沉淀階段均高于曝氣階段,K廠中沉淀階段豐度高于曝氣階段的1.03~3.77倍,J廠中沉淀階段豐度高于曝氣階段的1.57~2.50倍,說(shuō)明沉淀階段是富集ARGs的主要階段;抗性基因OXA-1和OXA-2豐度在2廠中持續(xù)增長(zhǎng),OXA-10豐度在K廠中有下降,在J廠中上升;OXA-1在K廠中豐度范圍5.82×105~2.91×107,在J廠豐度范圍為(4.84~ 7.58)×107;OXA-2在K廠中豐度范圍(4.46~3.45)×106,在J廠豐度范圍為4.37×109~1.09×1010;OXA-10在K廠中豐度范圍2.61×106~3.94×107,在J廠豐度范圍為1.04× 108~4.95×109.其中,OXA-10基因豐度在K廠中削減,在J廠中上升,且其余2種抗性基因豐度在2廠均不同程度上升,這和余忻[19]的結(jié)果一致,其結(jié)果表明污水處理工藝雖可削減污水中耐藥乳糖發(fā)酵型腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量和耐藥基因濃度,但會(huì)提高污水中的微生物對(duì)抗生素的耐藥率,并提高耐藥基因在微生物中的豐度,因此曝氣處理過(guò)程非但不能削減這2種ARGs豐度,反而刺激它大量擴(kuò)增,是重要的抗性基因污染源頭.

2.2 微生物群落多樣性分析

為了進(jìn)一步了解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因及微生物群落結(jié)構(gòu)在廢水處理過(guò)程中的分布和其相關(guān)性特征,采用Illumina高通量測(cè)序?qū)钚晕勰鄻悠分形⑸锞哼M(jìn)行多樣性分析.

表3 活性污泥中菌群多樣性指數(shù)

表3為6個(gè)樣品的Alpha多樣性指標(biāo).其中, Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)表明各處理單元細(xì)菌群落和物種的多樣性,其中豐富度指數(shù)Chao1可以估算群落中含OTU數(shù)目的指數(shù),在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù),值越大代表物種總數(shù)越多[20].從該指數(shù)來(lái)看, K廠中,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),下降幅度均為33.37%,說(shuō)明后續(xù)處理水質(zhì)穩(wěn)定,功能性菌群占據(jù)主導(dǎo)地位造成群落結(jié)構(gòu)逐漸集中化;而J廠的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在升高,可能是J廠水質(zhì)成分復(fù)雜COD,氨氮較高,菌群多樣性較高.

Shannon指數(shù)反映了基于物種數(shù)量的群落種類(lèi)多樣性,指數(shù)越大表明群落的復(fù)雜程度越高[21],K廠隨著水質(zhì)好轉(zhuǎn),指數(shù)持續(xù)下降,下降的平均幅度為35.15%,J廠中指數(shù)升高,可能是水廠運(yùn)行不穩(wěn)定導(dǎo)致.Simpson指數(shù)體現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)物種生物量占群落生物總量的比重,該指數(shù)越大表明優(yōu)勢(shì)菌群生物量占總生物量比重越大,反之則優(yōu)勢(shì)菌群生物量占總生物量的比重越小[22],表3中K廠指數(shù)先下降后升高,優(yōu)勢(shì)菌群生物量所占總生物量比重先下降后升高,J廠指數(shù)沒(méi)有發(fā)生變化,優(yōu)勢(shì)菌群生物量所占總生物量比重不變.

2.3 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 在門(mén)分類(lèi)水平上分析 利用Miseq高通量測(cè)序分析技術(shù)在門(mén)水平上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行歸類(lèi),分析所取7個(gè)污泥樣品的菌群組成及相對(duì)豐度差異,結(jié)果如圖2所示.

圖2 門(mén)水平下微生物群落相對(duì)豐度

由圖2可見(jiàn),在門(mén)級(jí)別,兩制藥廢水廠各樣品中(G~HC)共統(tǒng)計(jì)到48個(gè)菌門(mén).K廠污泥樣品中,變形菌門(mén)(Proteobacteria),浮霉菌門(mén)(Planctomycetes),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),綠彎菌門(mén)(Chloroflexi),酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等為優(yōu)勢(shì)菌門(mén),平均總相對(duì)豐度比例占到82.13%,且總體差異較小.K廠主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與鄭向陽(yáng)等[23]淀粉污水處理廠和AO反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)種類(lèi)大致相同,其總相對(duì)豐度差異可能是制藥廢水與淀粉污水在水質(zhì)水量上的不同導(dǎo)致.在A和C單元中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度明顯升高,這和康曉榮[24]的研究,Proteobacteria和Bacteroidetes隨著總氮和總磷去除率的提高,其豐度也相應(yīng)增加,具有重要的硝化及反硝化脫氮除磷作用的結(jié)論一致.Planctomycetes和Chloroflexi相對(duì)豐度逐漸減少;Bacteroidetes相對(duì)豐度逐漸升高; Acidobacteria相對(duì)豐度基本保持不變?cè)?.60%左右,且5種主要菌門(mén)在整個(gè)處理流程中占到總相對(duì)豐度77.03%~88.41%.J廠污泥樣品中,變形菌門(mén)(Proteobacteria),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia),芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes),棲熱菌門(mén)(Thermi)等為優(yōu)勢(shì)菌門(mén),總平均相對(duì)豐度比例占到85.76%.其中J廠的變形菌門(mén)在所有活性污泥樣品中所占的比例也最多,HB的相對(duì)豐度為60.00%,HC的相對(duì)豐度為56.55%.

兩廠中變形菌門(mén)在所有活性污泥樣品中所占的比例最多,占每個(gè)活性污泥樣品細(xì)菌總相對(duì)豐度的37.66%~63.38%范圍內(nèi),為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén).這與Liu等[25]研究結(jié)果一致,其通過(guò)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物造粒流化床反應(yīng)器對(duì)不同時(shí)期的微生物群落進(jìn)行多樣性分析,所得的18個(gè)分類(lèi)操作單元中,有11個(gè)屬于變形菌門(mén),3個(gè)屬于放線菌門(mén),表明變形菌門(mén)在污水處理中屬于較優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類(lèi)群.說(shuō)明不僅僅是污水處理,制藥廢水處理中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)也為變形菌門(mén).

2.3.1 在屬分類(lèi)水平上分析 在屬水平上對(duì)樣品及其所含菌屬進(jìn)行聚類(lèi)分析,并根據(jù)各樣品中不同OTU所含豐度繪制熱圖,以反映在菌屬水平上聚類(lèi)差異及群落結(jié)構(gòu)差異性,如圖3所示.

從總體來(lái)看,K廠與J廠在菌群結(jié)構(gòu)上差異性較大,為便于分析,將各樣品微生物熱圖劃分為3個(gè)Cluster.從Cluster 1和Cluster 2來(lái)看,K廠與J廠菌群豐度差異性較大,其中,B和D與其余單元菌屬豐度差異性較大,豐度較高的是、、、和等菌類(lèi),其中,(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌屬之一[26],K廠中豐度較高,反映出K廠脫氮效果強(qiáng)于J廠.A和C單元與其他樣品單元差異性較大,差異性較大的菌屬為、和等,其中是活性污泥中與反硝化作用有關(guān)的菌屬[27],在K廠中豐度較高.從脫氮相關(guān)菌屬豐度可看出K廠較J廠氨氮去除效果好.Cluster 3包含、、、和等菌屬,其中,是活性污泥中與反硝化作用有關(guān)的菌屬[27],在好氧和厭氧的條件下都有良好的脫氮效果[28].

圖3 屬水平下的前50個(gè)物種相對(duì)豐度

有研究表明,活性污泥中與反硝化作用有關(guān)的主要菌屬包括:、、、、和等[27].在本研究中,也發(fā)現(xiàn)了、和等可能參與反硝化作用的細(xì)菌類(lèi)群,其相對(duì)豐度如表4所示.由表4可知,為J廠中豐度最高菌群,并且(陶厄氏菌屬)是主要的反硝化脫氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解過(guò)程中起了十分重要的作用[29],為K廠豐度最高菌群,且各菌屬隨水質(zhì)變化成一定的演替規(guī)律.

表4 各樣品反硝化相關(guān)菌群相對(duì)豐度

變化較為明顯的是、、、、、a17、等,其中Nitrospira(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌屬之一[26];(芽孢桿菌屬)為污水廠中廣泛存在的菌屬[30-31].從Cluster 3來(lái)看,1B與1C的相對(duì)菌屬豐度較高,分別為,,等,其中(生絲微菌屬)為病原菌[32],且對(duì)污染土壤有較好的修復(fù)能力.Cluster 4大部分菌群屬于硝化菌、反硝化菌,并且(陶厄氏菌屬)是主要的反硝化脫氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解過(guò)程中起了十分重要的作用[29];(副球菌屬)在好氧和厭氧的條件下都有良好的脫氮效果[28].

2.4 微生物群落和抗性基因相關(guān)性分析

2.4.1 主成分分析和冗余分析 微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)影響ARGs的產(chǎn)生和豐度[14],但是微生物群落結(jié)構(gòu)在環(huán)境樣本中對(duì)ARGs擴(kuò)增影響的研究還是有限的.通過(guò)高通量測(cè)序和熒光定量方法來(lái)分析污水處理系統(tǒng)中微生物群落和抗性基因分布的相關(guān)性.

首先對(duì)2座廠的6個(gè)樣本進(jìn)行主成分分析(圖4a),然后選取COD、氨氮、抗性基因OXA-1, OXA-2和OXA-10作為環(huán)境因子,結(jié)合各樣本微生物群落結(jié)構(gòu),選取2廠中15種相對(duì)豐度較高的菌屬作為樣本,利用冗余分析(RDA)方法研究微生物與環(huán)境因子的相關(guān)性,結(jié)果見(jiàn)圖4b.

對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行主成分分析,結(jié)果(圖4a)表明,PC1(主成分1)表示2組間差異中可以解釋全面分析結(jié)果的85.36%,PC2(主成分2)表示2組間差異中可以解釋全面分析結(jié)果的12.92%,2點(diǎn)之間的距離越近,表明2個(gè)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高,差異越小.從圖中可看出3組間應(yīng)該有明顯的差異性,J廠的HC和HB樣本單元分布較近,K廠的D和B單元分布較近,其余K廠的A和C單元分布較近,這3組組內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高,且每組樣本與樣本之間的距離呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律.

a. 樣本主成分分析;b. 微生物與環(huán)境因子

對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行冗余分析,結(jié)果表明(圖4b),主軸1和主軸2共解釋了微生物群落結(jié)構(gòu)和水質(zhì)、抗性基因參數(shù)的98.04%,其中,微生物群落中、、以及等菌屬與-,-和-3種抗性基因和氨氮呈正相關(guān),、和e等與-抗性基因呈正相關(guān),、和與COD和-呈正相關(guān),和與COD正相關(guān).

在制藥廢水活性污泥中,Bdellovibrio、KD8-87、Paracoccus以及B-42等菌屬可能是-、-和-3種抗性基因的主要攜帶菌屬,、和可能是-的主要攜帶菌屬,其中Guo等[33]從Comamonas sp.GTP4(Comamonadaceae)中檢測(cè)到-型抗性基因全序列;、、和可能是-分布的主要攜帶菌屬,其中Laviad等[34]從AIMA4 (DSM 19884)(Betaproteobacteria)中檢測(cè)到-基因的全序列,Amiri等[35]從SWB007(Myxococcales)中檢測(cè)到-基因的全序列.Ellin6075和Methyloversatilis與COD正相關(guān),可能是這2種菌屬較適應(yīng)有機(jī)負(fù)荷高的污水.其余菌屬可能是未被檢測(cè)發(fā)現(xiàn),有待進(jìn)一步研究.

3 結(jié)論

3.1 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因-,-,-在2個(gè)水廠中各個(gè)階段的檢出頻率均為100%.生物曝氣處理過(guò)程非但不能削減-和-豐度,反而刺激它大量擴(kuò)增,是某些抗性基因的重要污染源頭.二級(jí)曝氣處理系統(tǒng)對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)-型抗性基因有一定的去除效果.

3.2 兩制藥廢水廠中,K廠中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria),浮霉菌門(mén)(Planctomycetes),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),綠彎菌門(mén)(Chloroflexi),酸桿菌門(mén)(Acidobacteria),平均總相對(duì)豐度比例占到82.13%.J廠污泥樣品中,主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia),芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes),棲熱菌門(mén)(Thermi),總平均相對(duì)豐度比例占到85.76%.

3.3 生物群落中、KD8-87、以及B-42等菌屬可能是、和3種抗性基因的主要攜帶菌屬,、和可能是抗性基因的主要攜帶菌屬,、、和可能是的主要攜帶菌屬.

[1] Borg M A, Zarb P, Scicluna E A, et al. Antibiotic consumption as a driver for resistance in Staphylococcus aureus and Escherichia coli within a developing region [J]. Ajic American Journal of Infection Control, 2010,38(3):212-216.

[2] Naquin A, Shrestha A, Sherpa M, et al. Presence of antibiotic resistance genes in a sewage treatment plant in Thibodaux, Louisiana, USA [J]. Bioresource Technology, 2015,188(11):79-83.

[3] Tong Z, Zhang X X, Lin Y. Plasmid metagenome reveals high levels of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in activated sludge [J]. Plos One, 2011,6(10):e26041.

[4] Pehrsson E C, Tsukayama P, Patel S, et al. Interconnected microbiomes and resistomes in low-income human habitats [J]. Nature, 2016,533(7602):212-216.

[5] He L Y, Ying G G, Liu Y S, et al. Discharge of swine wastes risks water quality and food safety: Antibiotics and antibiotic resistance genes from swine sources to the receiving environments [J]. Environment International, 2016:92-93.

[6] Pruden A, Pei R, Storteboom H, et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in northern Colorado [J]. Environmental Science & Technology, 2006,40(23):7445-7450.

[7] 王玉倩,薛秀花.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用 [J]. 生物學(xué)通報(bào), 2016,51(2):1-6.Wang Y Q, Xue X H. The application and development of real-time fluorescent quantitative PCR [J].Bulletin of Biology, 2016, 51(2):1-6.

[8] Aydin S, Ince B, Ince O. Development of antibiotic resistance genes in microbial communities during long-term operation of anaerobic reactors in the treatment of pharmaceutical wastewater [J]. Water Research, 2015,83(4):337-344.

[9] Liu M, Zhang Y, Yang M, et al. Abundance and distribution of tetracycline resistance genes and mobile elements in an oxytetracycline production wastewater treatment system [J]. Environmental Science & Technology, 2012,46(14):7551-7557.

[10] Guo X, Yan Z, Zhang Y, et al. Behavior of antibiotic resistance genes under extremely high-level antibiotic selection pressures in pharmaceutical wastewater treatment plants [J]. Science of the Total Environment, 2017,612:119-128.

[11] 張佳奇.湘江流域β內(nèi)酰胺抗性基因污染特征與影響因素研究 [D]. 天津:天津大學(xué), 2015. Zhang J Q. Pollution characteristics and influencing factors of beta lactam resistant genes in Xiangjiang Basin [D]. Tianjin: Tianjin University, 2015.

[12] Li Y, Sun Q L, Shen Y, et al. Rapid increase in the prevalence of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) and emergence of colistin resistance gene mcr-1in CRE in a hospital in Henan, China [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2018,JCM.01932-01917.

[13] Diwan V, Chandran S P, Tamhankar A J, et al. Identification of extended-spectrum β-lactamase and quinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from hospital wastewater from central India [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012,67(4):857-859.

[14] Yang Y, Li B, Zou S, et al. Fate of antibiotic resistance genes in sewage treatment plant revealed by metagenomic approach [J]. Water Research, 2014,62(7):97-106.

[15] Zhang T, Li B. Occurrence, transformation, and fate of antibiotics in municipal wastewater treatment plants [J]. Critical Reviews in Environmental Science & Technology, 2011,41(11):951-998.

[16] Wang J, Mao D, Mu Q, et al. Fate and proliferation of typical antibiotic resistance genes in five full-scale pharmaceutical wastewater treatment plants [J]. Science of the Total Environment, 2015,526(4):366-373.

[17] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. 水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法. [M]. 4版.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002. The State Environmental Protection Administration. Water and wastewater monitoring and analysis method [M]. 4th Edition. Beijing: China Environmental Science Press, 2002.

[18] 翟文超.抗生素抗性基因在抗生素制藥廢水處理過(guò)程中的分布特征及控制原理研究 [D]. 天津:南開(kāi)大學(xué), 2014. Zhai W. The fate and control principle of antibiotic resistance genes in pharmaceutical wastewater treatment systems [D]. Tianjin: Nankai University, 2014.

[19] 余 忻.抗生素廢水的生物毒性與微生物耐藥性及其控制技術(shù)研究 [D]. 北京:清華大學(xué), 2014.Yu X. Biotoxicity and antimicrobial resistance of antibiotic wastewater and its control technology [D]. Beijing: Tsinghua University, 2014.

[20] Shu D, He Y, Yue H, et al. Metagenomic insights into the effects of volatile fatty acids on microbial community structures and functional genes in organotrophic anammox process [J]. Bioresource Technology, 2015,196:621-633.

[21] 王 智,張志勇,張君倩,等.水葫蘆修復(fù)富營(yíng)養(yǎng)化湖泊水體區(qū)域內(nèi)外底棲動(dòng)物群落特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2012,32(1):142-149. Wang Z, Zhang Z Y, Zhang J Q, et al. The fauna structure of benthic macro-invertebrates for environmental restoration in a eutrophic lake using water hyacinths [J]. China Environmental Science, 2012,32(1): 142-149.

[22] 刁曉君,李一葳,王曙光.水華生消過(guò)程對(duì)巢湖沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,(1):107-113. Diao X J, Li Y W, Wang S G. Effects of outbreak and extinction of algal blooms on the microbial community structure in sediments of Chaohu Lake [J]. Environmental Science, 2015,(1):107-113.

[23] 鄭向陽(yáng),羅 曉,袁立霞,等. AO工藝處理淀粉污水效能及微生物群落解析[J/OL] [J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2018,3:804-814. Zheng X, Luo X, Yuan L, et al. Performance and bacterial community analysis of AO process treating starch wastewater [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2018,12(3):804-814.

[24] 康曉榮.超聲聯(lián)合堿促進(jìn)剩余污泥水解酸化及產(chǎn)物研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013. Kang X R. Study on hydrolysis and acidification of activated sludge enhanced by ultrasound combined with alkaline [D]. Harbin:Harbin institute of technology, 2013.

[25] Liu Y J, Wang X C, Yuan H L. Characterization of microbial communities in a fluidized-pellet-bed bioreactor for wastewater treatment [J]. Desalination, 2009,249(1):445-452.

[26] Nielsen P H, Mielczarek A T, Kragelund C, et al. A conceptual ecosystem model of microbial communities in enhanced biological phosphorus removal plants [J]. Water Research, 2010,44(17):5070- 5088.

[27] 高大文,辛?xí)詵|.MBR膜污染過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝產(chǎn)物分析 [J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,46(2):26-32. Gao D W, Xin X D. Analysis of microbial community structure and metabolites during the MBR membrane fouling process [J]. Journal of Harbin Institute of Technology, 2014,46(2):26-32.

[28] 劉 燕,甘 莉,黃哲強(qiáng),等.脫氮副球菌YF1目的反硝化特性研究 [J]. 水處理技術(shù), 2010,36(10):61-65. Liu Y, Gan L, Huang Z Q, et al. Study on denitrification characteristics of[J]. Technology of Water Treatment, 2010,36(10): 61-65.

[29] 李衛(wèi)華,孫英杰,劉子梁,等.序批式生物反應(yīng)器填埋場(chǎng)脫氮微生物多樣性分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2016,37(1):342-349. Li W, Sun Y, Liu Z, et al. analysis on diversity of denitrifying microorganisms in sequential batch bioreactor landfill [J]. Environmental Science, 2016,37(1):342-349.

[30] 魏京燾,龔 雪,李 雪,等.不同地區(qū)污水廠尾水中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,(11):23-25. Wei J, Gong X, Li X, et al. Research on the Diversity of microbial community structure of tail water from sewage plants in different areas [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2016,(11):23-25.

[31] 羅 曉,鄭向陽(yáng),趙叢叢,等.A/O工藝中污泥濃度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2018,38(1):275-283. Luo X, Zheng X, Zhao C, et al. Effects of sludge concentration on microbial community structure in A/O process [J]. China Environmental Science, 2018,38(1):275-283.

[32] 孫 濤.水的深度處理生物安全性及自養(yǎng)反硝化研究 [D]. 北京:中國(guó)地質(zhì)大學(xué), 2009. Sun T. Study on biological safety and autotrophic denitrification of advanced treatment of water [D]. Beijing: China University of Geosciences, 2009.

[33] Guo X, Xia R, Han N, et al. Genetic diversity analyses of class 1integrons and their associated antimicrobial resistance genes in Enterobacteriaceae strains recovered from aquatic habitats in China [J]. Letters in Applied Microbiology, 2011,52(6):667-675.

[34] Laviad S, Lapidus A, Han J, et al. High quality draft genome sequence of Brachymonas chironomi AIMA4(T) (DSM 19884 (T)) isolated from asp. egg mass.[J]. Standards in Genomic Sciences, 2015,10(1):29.

[35] Amiri J M, Poehlein A, Fisch K, et al. Draft genome sequences of the obligatory marine myxobacterial strains enhygromyxa salina SWB005 and SWB007 [J]. Genome Announcements, 2018,6(17): e00324-18.

Correlation study between resistance genes and microbial communities in pharmaceutical wastewater treatment plants.

LUO Xiao1,2, YUAN Li-xia2, ZHANG Wen-li2, ZHONG Wei-zhang1*, JIANG Yong-feng2, ZHANG Ying2, XU Dong-sheng2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China；2.School of Civil Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China)., 2019,39(2)：831~838

The distribution characteristics, amplification and correlation of microbial communities and β-lactam resistance genes in active sludge were studied by Miseq sequencing analysis and fluorescence quantitative PCR. The samples of active sludge were obtained from the biological aeration stages of two pharmaceutical wastewater treatment plant (Plant J and K). β-lactam resistance genes OXA-1, OXA-2 and OXA-10can be detected in both plants. The abundance of OXA gene was 5.82×105~3.94×107copies/g (dry weight) in K plant and was 4.84×107~1.09×1010copies/g in J plant. The Abundance of three genes in aeration treatment is significantly amplified. Miseq sequencing showed that the main dominant bacterium were Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteroidetes, Chloroflexi and Acidobacteriain K plant and the total average relative abundance ratio was 85.76%. The main dominant bacterium were Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetesand Thermiin J plant, the total average relative abundance ratio was 85.76%. Redundancy analysis display showed that、andin biological community were the major distribution factors of OXA-1、OXA-2 and OXA-10.、ande were the major distribution factor of OXA-1.、andwere the major distribution factor of OXA-10.

β-lactam resistance genes；fuorescence quantitative PCR；miseq；microbial community structure

X172

A

1000-6923(2019)02-0831-08

羅 曉(1973-),男,廣東崖縣人,副教授,博士,主要從事水污染控制研究.發(fā)表論文50余篇.

2018-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51708170)

* 責(zé)任作者, 講師, zhongweizhang@aliyun.com