細(xì)胞焦亡在眼部疾病中的研究進(jìn)展△

張敏 李志堅 王亞敏

細(xì)胞凋亡、壞死、自噬是經(jīng)典的細(xì)胞死亡方式，在眼部疾病中已有了較多的研究。而細(xì)胞焦亡是近些年來發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞死亡方式，在各種系統(tǒng)性疾病中已有報道，為多種疾病的防治帶來了希望。迄今為止老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)、白內(nèi)障等眼部疾病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但近些年來細(xì)胞焦亡在眼部疾病的研究中取得了一些進(jìn)展，為這些疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供了新的思路，也為治療這些疾病帶來了希望。

1細(xì)胞焦亡概述

細(xì)胞焦亡是繼細(xì)胞凋亡和壞死之后發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞程序性、伴有炎性因子參與的死亡方式[1]。細(xì)胞焦亡與凋亡相似，表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮、外吐小泡、DNA斷裂、Annexin V及TUNEL染色陽性；同時也與壞死的細(xì)胞相似，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹破裂、釋放胞內(nèi)容物，并引起炎癥反應(yīng)，因此細(xì)胞焦亡又被稱為細(xì)胞炎性壞死[2-3]。

研究已證明，在人和小鼠的細(xì)胞內(nèi)存在兩種死亡方式，分別為經(jīng)典焦亡途徑和非經(jīng)典焦亡途徑，細(xì)胞受到不同的刺激時通過不同的信號通路啟動焦亡途徑。(1)經(jīng)典焦亡途徑：首先不同的NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)蛋白對相應(yīng)的刺激信號產(chǎn)生選擇性應(yīng)答，接著半胱天冬氨酸酶1前體(precursor caspase-1，Pro-caspase-1)通過接頭蛋白凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARO，ASC)與NLR受體蛋白連接，從而形成一個高分子復(fù)合物，即含caspase-1經(jīng)典性小體，Pro-caspase-1二聚體化，激活自身蛋白酶活性，自身剪切成有催化活性的caspase-1，caspase-1激活GasderminD蛋白(GSDMD)，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，使成熟的白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18分泌到細(xì)胞外。(2)非經(jīng)典焦亡途徑：即人的caspase-4/5或小鼠的caspase-11以胞內(nèi)受體的方式結(jié)合細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，導(dǎo)致caspases水解活性被激活，直接剪切GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞裂解死亡，同時caspase-1在非經(jīng)典焦亡途徑中同樣被NLRP3(NLR受體的一種)和ASC的結(jié)合體活化，將無活性的IL-1β前體(precursor interleukin-1β，Pro-IL-1β)較為成熟的IL-1β釋放到細(xì)胞外。不論是經(jīng)典焦亡途徑還是非經(jīng)典焦亡途徑，最終均由執(zhí)行蛋白GSDMD執(zhí)行焦亡[4-5]。GSDMD被活化后的炎性caspase切割后釋放有活性的N端結(jié)構(gòu)域，并同源集聚形成多聚體，與細(xì)胞膜內(nèi)磷脂酰肌醇磷酸和磷脂酰甘油等脂類特異性結(jié)合，從細(xì)胞內(nèi)部貫穿于質(zhì)膜，形成水通道，破壞質(zhì)膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹而焦亡，同時細(xì)胞因子IL-1β和IL-18被釋放到細(xì)胞外，募集其他炎性細(xì)胞并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[6-8]。

2細(xì)胞焦亡在眼部相關(guān)疾病中的研究

2.1細(xì)胞焦亡在AMD中的研究AMD是一種進(jìn)行性疾病，其特點(diǎn)是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)退化，黃斑區(qū)光感受器萎縮[9-10]。AMD是影響≥50歲人群的常見的眼部疾病，正逐漸成為世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題。AMD晚期呈現(xiàn)出兩種不同類型：脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV，濕性)和地圖樣萎縮(geographic atrophy，GA，干性)。目前CNV可以通過抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)治療來進(jìn)行臨床管理[11]。然而還沒有有效的治療方法來緩解GA。

血中同型半胱氨酸水平隨著年齡的增長而升高，已有研究表明高同型半胱氨酸血癥與AMD發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Singh等[12]提出一個新穎的AMD發(fā)病機(jī)制假說：高同型半胱氨酸血癥的損傷啟動視網(wǎng)膜組織中的炎癥反應(yīng)，從而啟動AMD疾病進(jìn)程，產(chǎn)生的炎癥因子介導(dǎo)細(xì)胞焦亡啟動，接著通過對各種免疫因子及視網(wǎng)膜各種細(xì)胞受體上調(diào)，導(dǎo)致非特異性免疫及特異性免疫反應(yīng)，致使白細(xì)胞滲透和局部組織破壞，引發(fā)慢性炎癥性變化，包括晚期新生血管化。對炎癥分子和細(xì)胞焦亡的中心事件進(jìn)行研究可能有助于阻滯甚至阻止老年人群中的AMD疾病進(jìn)程。該假設(shè)還需進(jìn)一步研究來證實(shí)。

AMD進(jìn)程中各種視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡方式也無明確定論。近期有部分動物研究給出了一些思路。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-18和IL-17A可以通過細(xì)胞焦亡、壞死性凋亡和凋亡誘導(dǎo)鼠的多效視網(wǎng)膜干細(xì)胞(multipotent retinal stem cell，RSC)死亡，它們還會引起RSC的促炎反應(yīng)，通過caspase-1的激活促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟，該過程是細(xì)胞焦亡中的一部分。但此研究有局限性，RSC不是分化成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞，并不能說明成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的情況。Gao等[14]在大鼠眼內(nèi)注射淀粉樣蛋白，引起眼內(nèi)炎癥反應(yīng)，然后檢測RPE細(xì)胞的死亡方式，發(fā)現(xiàn)了在嚙齒動物眼中NLRP3炎癥因子激活RPE細(xì)胞焦亡和凋亡途徑的證據(jù)，并且證實(shí)了GSDMD的裂解與RPE中的炎癥激活有關(guān)，為該模型的細(xì)胞焦亡參與提供了分子基礎(chǔ)。光感受器萎縮是AMD的一個特征，Viringipurampeer等[15]研究發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜退化模型P23H視紫紅質(zhì)突變鼠中，不同的信號通路被激活，視桿細(xì)胞死亡途徑主要是細(xì)胞壞死，而視錐細(xì)胞死亡途徑主要是細(xì)胞焦亡，該研究還發(fā)現(xiàn)死亡細(xì)胞的臨近細(xì)胞死亡是通過P2RX7細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的，說明細(xì)胞的死亡可以相互傳播。

光的氧化損傷和NLRP3炎癥因子的激活已被證實(shí)是AMD的影響因素。NLR受體對不同刺激信號選擇性應(yīng)答是細(xì)胞焦亡通路的起始。Tseng等[16]通過對AMD患者和非AMD患者眼組織進(jìn)行NLRP3染色，發(fā)現(xiàn)在GA和CNV患者的RPE中發(fā)生了NLRP3上調(diào)，在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞19系(human retinal pigment epithelium-19，ARPE-19)細(xì)胞中，溶酶體的不穩(wěn)定誘發(fā)了NLRP3炎癥因子活化，從而誘導(dǎo)出啟動細(xì)胞焦亡的有效促炎細(xì)胞因子IL-1β的分泌，這些過程可能構(gòu)成了AMD發(fā)病的新機(jī)制。Brandstetter等[17]用藍(lán)光照射原代視網(wǎng)膜色素上皮(primary retinal pigment epithelium，pRPE)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的ARPE-19細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，然而預(yù)先用IL-1α和補(bǔ)體成分5a受體1(complement component 5a receptor 1，C5a)等炎癥因子預(yù)處理組則表現(xiàn)為細(xì)胞焦亡，說明諸如IL-1α和C5a等物質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)改變了細(xì)胞死亡機(jī)制，使細(xì)胞從凋亡到細(xì)胞焦亡；該研究還表明有脂褐素積累的RPE細(xì)胞中，光氧化損傷導(dǎo)致了NLRP3炎癥因子的激活，并釋放出IL-1β和IL-18，通過抑制caspase-1或cathepsins B/L來抑制炎癥因子激活可以顯著減少細(xì)胞死亡，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

這些研究表明在AMD的發(fā)病及進(jìn)程中，細(xì)胞焦亡參與了不同類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞的死亡。炎癥因子激活也是激活細(xì)胞焦亡的重要環(huán)節(jié)，而細(xì)胞焦亡并不是獨(dú)立的，與其他細(xì)胞死亡方式之間也有交叉。炎癥因子在細(xì)胞間的傳遞還會導(dǎo)致死亡的播散。由此可看出細(xì)胞焦亡的研究在AMD的發(fā)病機(jī)制及治療方面有重要的價值。

2.2細(xì)胞焦亡在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的研究白內(nèi)障作為一個全球性的問題是老年人失明的主要原因，幾乎占了視力殘疾者的一半。手術(shù)已經(jīng)成為治療白內(nèi)障的一種有效的方法，但是存在手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險。了解白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制可能會預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)展，從而減少全世界范圍內(nèi)的白內(nèi)障負(fù)擔(dān)。

晶狀體上皮細(xì)胞死亡是非先天性白內(nèi)障起始和進(jìn)展的細(xì)胞基礎(chǔ)。Jin等[18]研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織中caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)比正常對照組顯著增加。在H2O2處理過的晶狀體上皮細(xì)胞中加入caspase-1抑制劑，與只用H2O2處理過的晶狀體上皮細(xì)胞組相比，細(xì)胞焦亡顯著減少，caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)也顯著減少。細(xì)胞焦亡參與了晶狀體上皮細(xì)胞的氧化，并可能涉及非先天性白內(nèi)障的啟動和進(jìn)展。

KCNQ1OT1可以調(diào)節(jié)在Kcnq1區(qū)域內(nèi)特定組織的印跡基因的表達(dá)。印跡基因是細(xì)胞凋亡的積極調(diào)控因子，而細(xì)胞凋亡參與了白內(nèi)障形成，印跡基因可為白內(nèi)障治療提供新的治療靶點(diǎn)。Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA KCNQ1OT1通過miR-214激活了caspase-1焦亡途徑，促進(jìn)了白內(nèi)障形成，caspase-1是miR-214的下游目標(biāo)，KCNQ1OT1的敲除減少了caspase-1的表達(dá)，說明KCNQ1OT1-miR-214-caspase-1調(diào)控途徑是促進(jìn)白內(nèi)障形成的一種新的機(jī)制。該新型白內(nèi)障形成機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可為今后研究白內(nèi)障預(yù)防和治療的新策略提供了依據(jù)。

2.3細(xì)胞焦亡在角膜炎中的研究角膜炎是導(dǎo)致角膜潰瘍的主要原因，會導(dǎo)致患病者視力障礙和失明。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM2)中表達(dá)的受體是一種新型的細(xì)胞表面受體，在感染性疾病中作為免疫調(diào)節(jié)受體起作用。Qu等[20]研究了TREM2在銅綠假單胞菌角膜炎中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。發(fā)現(xiàn)缺乏TREM2鼠比野生型鼠角膜炎更嚴(yán)重。這是由于缺乏TREM2導(dǎo)致caspase-1增加和隨后細(xì)胞焦亡的激活及IL-1β釋放。此外caspase-1抑制劑抑制細(xì)胞焦亡后，不僅逆轉(zhuǎn)了缺乏TREM2小鼠的嚴(yán)重角膜病變，而且恢復(fù)了因TREM2缺乏導(dǎo)致的銅綠甲單胞菌的清除抑制。該研究表明通過抑制caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡，TREM2能促進(jìn)宿主對銅綠假單胞菌的抵抗，為TREM2的抗細(xì)菌免疫提供了新的見解，同時也為銅綠假單胞菌性角膜炎的治療提供了新的方向。

2.4細(xì)胞焦亡在閉合性眼爆炸傷中的研究眼外傷是全球第4大導(dǎo)致失明的原因。Bricker-Anthony等[21]用小鼠閉合性眼爆炸傷模型對眼閉合性爆照傷后的損傷及其機(jī)制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)過度壓力的空氣沖擊波會導(dǎo)致視網(wǎng)膜的所有層面發(fā)生分子和細(xì)胞的變化，導(dǎo)致區(qū)域性非凋亡細(xì)胞死亡和視力下降。爆炸傷傷后第3天在視網(wǎng)膜內(nèi)核層(inner nuclear layer retina，INL)發(fā)現(xiàn)caspase-1標(biāo)記陽性細(xì)胞，主要位于中邊緣視網(wǎng)膜，至28 d時80%的視網(wǎng)膜出現(xiàn)caspase-1陽性細(xì)胞，貫穿整個INL內(nèi)部。Caspase-1是通過無軸突細(xì)胞之間的縫隙連接傳播到鄰近細(xì)胞的。證明了細(xì)胞焦亡參與了閉合性眼爆炸傷的延遲性視力損傷，但其具體焦亡途徑還有待進(jìn)一步研究。

2.5細(xì)胞焦亡在三苯氧胺的視網(wǎng)膜毒性中的研究三苯氧胺(tamoxifen)是一種非甾體類雌激素受體拮抗劑，它被廣泛應(yīng)用于低劑量的治療中，作為治療某些形式的乳腺癌的輔助療法。三苯氧胺可以導(dǎo)致角膜毒性、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變和視神經(jīng)病變。據(jù)報道，接受治療患者的眼毒性副作用的發(fā)生率從6.3%到12.0%不等。其藥物毒性最大的不良反應(yīng)是黃斑病變。

Kim等[22]的研究發(fā)現(xiàn)在三苯氧胺作用的RPE細(xì)胞中出現(xiàn)caspase-1的激活和隨后產(chǎn)生的成熟的IL-1β和細(xì)胞焦亡的激活，證明了NLRP3炎癥因子的作用。加入caspase-1抑制劑后部分減少了細(xì)胞死亡，這表明雖然caspase-1確實(shí)與三苯氧胺介導(dǎo)的RPE細(xì)胞死亡有關(guān)，但細(xì)胞死亡并不主要是細(xì)胞焦亡引起的，還有其他途徑。在ARPE-19細(xì)胞中最初表現(xiàn)出溶酶體不穩(wěn)定，隨后釋放了cathepsins B、cathepsins L，該物質(zhì)在啟動多種細(xì)胞死亡機(jī)制中起著重要作用，包括細(xì)胞焦亡、凋亡和壞死性凋亡。對cathepsins B、cathepsins L雙重抑制完全阻止了由三苯氧胺引起的RPE細(xì)胞死亡。Cathepsins B和L的抑制劑可能是藥物抑制劑開發(fā)的可行性選擇。

3展望

細(xì)胞焦亡為許多病因不明的眼部疾病提供了新的思路。目前在AMD的發(fā)生機(jī)制中研究較多，且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡參與了視錐細(xì)胞、RPE細(xì)胞及多效視網(wǎng)膜干細(xì)胞死亡，但并不是單一因素，其共同的上游調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)可能為治療AMD提供希望。細(xì)胞焦亡在白內(nèi)障中也起一定作用，其通路上游基因抑制劑也許能減緩非先天性白內(nèi)障的發(fā)展，但是否與其他通路間有相互影響，有沒有共同的調(diào)控基因存在，這些問題仍需進(jìn)一步研究。細(xì)胞焦亡目前在眼部疾病中的研究較少，其前景十分值得期待。