復(fù)元醒腦湯干預(yù)糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織血管新生的實驗研究*

孫麗華 葉苗青 沈俊逸 閆 詔 解婉瑩 方邦江（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

目前糖尿病并發(fā)急性腦梗死的發(fā)病率、死亡率和復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后不良。糖尿病是腦梗死的獨立危險因素，數(shù)據(jù)顯示糖尿病患者的腦梗死風(fēng)險比非糖尿病患者高出1.5～3倍［1］。但是糖尿病性腦梗死的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及許多信號通路，包括糖脂代謝影響、內(nèi)皮功能、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等，迄今為止還尚未明確［2］。“復(fù)元醒腦法”治療中風(fēng)病是龍華醫(yī)院急診科作為國家級重點?？茖W(xué)科內(nèi)涵建設(shè)三大特色之一，臨床療效顯著。筆者在堅實的臨床基礎(chǔ)上，結(jié)合既往研究數(shù)據(jù)以及經(jīng)驗總結(jié)，認(rèn)為復(fù)元醒腦湯對于糖尿病腦梗死組織的修復(fù)應(yīng)該是多靶點調(diào)控的，故以干預(yù)損傷區(qū)域血管微循環(huán)系統(tǒng)的重建為切入點，進(jìn)行機制研究。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取150只健康的成年SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±25）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司（實驗動物合格證編號2008001671284），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技樓實驗動物中心。

1.2 藥物 復(fù)元醒腦湯：人參10 g（另煎），三七10 g，石菖蒲 12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，天南星 15 g，制大黃9 g（后下）。由上海市龍華醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供，生藥質(zhì)量濃度為388 g/L。二甲雙胍緩釋片由正大天晴藥業(yè)集團生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20031104。尼莫地平由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H33022285。

1.3 儀器及試劑 大鼠腦立體定位儀，深圳瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn)。掃描儀，明基電通有限公司生產(chǎn)。紫外分光光度計，北京長流科學(xué)儀器公司生產(chǎn)。低溫高速離心機，Sanyo-Japan生產(chǎn)。恒壓恒流電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)。凝膠成像儀，mersham Pharmacia Biotech生產(chǎn)。-80℃冰箱，Sanyo-Japan生產(chǎn)。脫水機，石蠟包埋機，石蠟攤片機，切片機，Leica-German生產(chǎn)。光學(xué)顯微鏡，攝像系統(tǒng)，Olympus-Janpan生產(chǎn)。電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀，BIO-BAD-USA生產(chǎn)。酶標(biāo)儀，Thermo-USA生產(chǎn)。恒溫?fù)u床，上海精密儀器制造公司生產(chǎn)。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海歐翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。鏈脲佐菌素（STZ），凝血酶，Sigma-USA 提供。PMSF，Amresco-USA提供。RIPA裂解液，Beyotime Biotechnology提供。BCA蛋白分析試劑盒，Amresco-USA提供。SDS-PAGE凝膠，SDS-PAGE上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳液，定影液、顯影液，均由Beyotime Biotechnology提供。

1.4 模型制備 將STZ試劑溶于pH4.6的檸檬酸鈉緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），大鼠腹腔注射STZ試劑（50 mg/kg），1周后制成糖尿病模型（隨機血糖＞16.7 mmol/L），并連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周。在此基礎(chǔ)上采用線栓法制備糖尿病腦梗死模型［3］。常規(guī)麻醉大鼠后，將大鼠以仰臥位固定于固定板上；剪去頸前的鼠毛，碘伏消毒，沿頸部正中部位切開皮膚和淺筋膜約2 cm左右。鈍性分離皮下組織，沿胸鎖乳突肌和頸前肌群肌間隙向深部分離，分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，見到頸動脈鞘后可上拉鉤，分離動脈鞘，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈的近心端，夾閉頸總動脈，夾閉頸內(nèi)動脈并從頸內(nèi)動脈插入線栓，然后進(jìn)入頸外動脈直至進(jìn)入中腦動脈，插入深度距頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉約為18 mm。將線栓和頸外動脈通過縫線結(jié)扎并固定。將頸內(nèi)動脈緊緊夾緊并切除額外的線栓線。成功后在線栓入口處結(jié)扎，縫合?？p合后，用酒精棉簽消毒皮膚縫合線，將大鼠放回籠中，并在2 h后拉動線栓進(jìn)行再灌注。在糖尿病組中，除未插入線栓之外，其余的手術(shù)過程與用于制備腦梗死模型的手術(shù)過程相同。

1.5 分組及給藥 健康SD大鼠150只，在常規(guī)喂養(yǎng)后隨機分為正常組30只與糖尿病模型組120只，糖尿病模型造模成功后，連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周，再將糖尿病模型組按每組均等例數(shù)隨機分為糖尿病模型假手術(shù)組（簡稱糖尿病組，予正常飼養(yǎng)+0.9%氯化鈉注射液）；糖尿病腦梗死大鼠模型組（簡稱模型組，予正常飼養(yǎng)+0.9%氯化鈉注射液）；糖尿病腦梗死大鼠模型中藥灌胃組（簡稱中藥治療組，予正常飼養(yǎng)+復(fù)元醒腦湯）；糖尿病腦梗死大鼠模型西藥灌胃組（簡稱西藥治療組，予正常飼養(yǎng)+西藥）4組。中藥治療組大鼠給予復(fù)元醒腦湯劑量 10.4 g/（kg·d），每日 2次。西藥治療組大鼠予二甲雙胍 27 mg/kg，每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日2次（具體實驗步驟和劑量參照陳琦的《中藥藥理實驗方法學(xué)》［4］根據(jù)實驗動物與體表面積的比值計算）。同時，模型組和糖尿病組給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。正常組未進(jìn)行干預(yù)，僅予常規(guī)喂養(yǎng)。連續(xù)灌胃14 d后處死取材。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）大鼠血糖測量。通過大鼠尾靜脈收集血液，并使用葡萄糖計和葡萄糖測試條在術(shù)前、術(shù)后7 d測量血糖水平。2）神經(jīng)功能評分。各組術(shù)后24 h和7 d實驗動物進(jìn)行Bederson評分：尾部抬高使大鼠懸于空中測試，在大鼠的尾巴舉起高度1 m處的狀態(tài)下觀察前肢的屈曲。0分為無缺陷。1分為對側(cè)前肢屈肌功能缺損。2分為尾部握住時，對側(cè)推和軀干轉(zhuǎn)向同側(cè)的阻力降低。3分為受影響側(cè)旋轉(zhuǎn)非常明顯，受影響側(cè)負(fù)重能力降低。4分為動物很少自發(fā)活動，喜歡躺下或休息。當(dāng)分值大于或者等于1分的時候，表明實驗動物模型制作成功。3）免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠新生血管的密度檢測。新生血管的標(biāo)記CD31進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，石蠟包埋組織4 μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。采用兔CD31免疫組化試劑盒，按說明書進(jìn)行操作。3%過氧化氫溶液封閉約10 min，PBS液沖洗3次，每次3 min，正常羊血清工作液37℃封閉30 min，傾去工作液，滴加一抗4℃孵育過夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照），PBS液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS液沖洗3次，每次3 min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，樹膠封片。陽性細(xì)胞呈棕黃色至褐色。4）透射電鏡檢測大鼠腦組織皮層的微血管超微結(jié)構(gòu)。每組各取2只大鼠，深度麻醉后，置冰上迅速斷頭取腦，沿視交叉處前后1 mm切開，在缺血梗死周圍皮質(zhì)取大約1 mm3（1 mm×1 mm×1 mm）組織，置入4℃2.5%戊二醛固定液中約2 h，配制0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次并固定2 h或更長時間，4℃保存，移入1%鋨酸固定液中固定2～3 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次。經(jīng)脫水、包埋、固化、超薄切片機50～60 nm切片、3%醋酸鈾-枸櫞酸鋁雙染色、透射電鏡觀察并拍片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用版本為Windows v.17的SPSS統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，組間的差異性檢測post hoc分析采用LSD-t。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖水平比較 見表1。術(shù)前糖尿病組、模型組、中藥治療組和西藥治療組大鼠與正常組比較，血糖均升高（均P＜0.01）。術(shù)后7 d中藥治療組與模型組比較，血糖降低（P＜0.05）；西藥治療組與模型組比較，血糖亦降低（P＜0.05）。中藥治療組與西藥治療組比較，差別不大（P＞0.05），表明無論是復(fù)元醒腦湯的中藥治療還是西藥治療均能降低血糖水平。

表1 各組大鼠術(shù)前術(shù)后血糖比較（mmol/L，x±s）

2.2 各組大鼠Bederson評分比較 見表2。手術(shù)后7 d正常組和糖尿病組大鼠Bederson評分為0分；模型組、中藥治療組和西藥治療組與正常組比較，Bederson評分均升高（均P＜0.01），表明與模型組、中藥治療組和西藥治療組大鼠仍有一定程度的神經(jīng)缺損。中藥治療組、西藥治療組與模型組比較，Bederson評分均降低（均P＜0.01）；中藥治療組與西藥治療組Bederson評分比較，差別不大（P＞0.05），表明無論是復(fù)元醒腦湯的中藥治療還是西藥治療均能顯著改善糖尿病腦梗死所導(dǎo)致的神經(jīng)缺損。

表2 各組大鼠Bederson評分比較（分，x±s）

2.3 各組大鼠缺血腦組織部位血管新生變化 見圖1。正常組血管豐富，血管壁較厚，管腔充滿；糖尿病組血管管壁較薄，管腔較厚，血管數(shù)量少，管腔受損。西藥治療組血管壁增厚。中藥治療組壁增厚有一定程度的血管生成，管腔增加。結(jié)果表明，中藥治療組和西藥治療組均對糖尿病性腦梗死的血管生成有影響，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。

圖1 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

2.4 各組大鼠腦皮層微血管超微結(jié)構(gòu)的變化 見圖2。使用透射電鏡檢測各組血管的基底膜狀態(tài)。結(jié)果表明，糖尿病組、正常組大鼠未見水腫及結(jié)構(gòu)破壞，但糖尿病組存在基底膜變薄現(xiàn)象；糖尿病組大鼠出現(xiàn)基底膜節(jié)段性不清甚至溶解、缺損，管腔縮??；中藥治療組、西藥治療組大鼠腦微管超微結(jié)構(gòu)的變化整體較糖尿病組有所改善。

3 討 論

腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，臨床數(shù)據(jù)顯示糖尿病會增加罹患腦缺血的風(fēng)險，例如缺血性腦卒中或心血管疾?。?-6］。糖尿病能加重腦血管疾病造成的損害，包括氧化應(yīng)激，白細(xì)胞功能受損，增加血腦屏障的滲透性以及炎癥反應(yīng)等一系列的血管病變，包括增加血管通透性而大大增加缺血性中風(fēng)的發(fā)病率［7］。事實上，腦梗死發(fā)生時，腦組織由于血管舒張功能受損導(dǎo)致腦血流量持續(xù)下降而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，機體將通過血管再生對缺血半影區(qū)進(jìn)行調(diào)節(jié)及重建功能性微血管系統(tǒng)從而維持神經(jīng)功能，并且為神經(jīng)元可塑性創(chuàng)造一個良好的微環(huán)境以利于其功能恢復(fù)［8］。

圖2 各組腦微血管超微結(jié)構(gòu)的比較（3%醋酸鈾-枸櫞酸鋁雙染色，10 000倍）

近年來，業(yè)界普遍認(rèn)同糖尿病腦梗死消渴并中風(fēng)病病機主旨在于 “氣虛為其根本、標(biāo)瘀痰阻絡(luò)為其標(biāo)實”，消渴并中風(fēng)病的基本治則以“補虛活血、祛痰通絡(luò)”為主。方邦江教授根據(jù)臨床中“消渴中風(fēng)病”的病機特點，總結(jié)前人治療急性腦血管病的經(jīng)驗，創(chuàng)新性提出了“復(fù)元醒腦法”，以培植元氣為根本大法，以逐瘀泄痰、祛熱息風(fēng)、通絡(luò)為輔，并自擬復(fù)元醒腦湯（人參、石菖蒲、天南星、三七、水蛭、益母草、大黃）治療中風(fēng)病取得良好臨床療效。方中人參培補中元之氣，補益脾肺清氣，為治本之君藥；天南星息風(fēng)清熱，定驚化痰；石菖蒲性芳香化濁祛痰、開腦竅，天南星與石菖蒲相互配合共為臣藥治療風(fēng)痰交阻腦竅之癥；三七與水蛭并用為臣藥活血止血，力專善走竄，周行全身經(jīng)絡(luò)。益母草為佐藥尤擅活血利水祛風(fēng)，方小力專；大黃為使，清熱兼解毒，通腑瀉下化瘀，使瘀、痰、熱、風(fēng)等有形和無形實邪得以出路；諸藥合用，共奏醒腦復(fù)神、逐瘀泄痰、祛熱息風(fēng)之功。實驗研究顯示，復(fù)元醒腦湯能夠治療中風(fēng)病的機制可能在于在腦梗死中可調(diào)整胰島素敏感相關(guān)指數(shù)，干預(yù)胰島素抵抗這一難題。有效保護(hù)和減少再灌注損傷對血-腦屏障造成的二次打擊和傷害，降低血-腦屏障的通透性，緩解腦水腫病變進(jìn)展的程度，減輕大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的腫脹程度，減輕微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，改善炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而改善神經(jīng)缺損行為評分，促進(jìn)建立損傷區(qū)域局部神經(jīng)與血管的新生和側(cè)支循環(huán)重建［9-15］。

本次實驗筆者通過大鼠血糖水平、Berderson評分、透射電鏡觀察各組血管基底膜狀態(tài)等方面綜合評估糖尿病并發(fā)腦梗死動物模型。結(jié)果證實復(fù)元醒腦湯和西藥組均改善了糖尿病腦梗死大鼠的血糖水平，糖尿病腦梗死的主要病理特征是由于供血不足所導(dǎo)致的組織梗死以及梗死中心周圍組織的缺氧缺血，所以重建血管以恢復(fù)血液循環(huán)對于腦梗死后的糖尿病缺血性腦組織十分重要。CD31作為血管內(nèi)皮細(xì)胞新生的重要標(biāo)志［15］，通過免疫組化染色顯示糖尿病腦梗死組織血管管壁斷裂，內(nèi)皮細(xì)胞受損，管腔縮小，復(fù)元醒腦湯治療后，糖尿病腦梗死大鼠缺血區(qū)新生血管數(shù)增多，血管壁較完整，血管直徑增厚。除此之外，筆者使用透射電鏡檢測了各組血管基底膜狀態(tài)，可以觀察到糖尿病組、正常組大鼠血管結(jié)構(gòu)未見明顯破壞，但糖尿病組存在基底膜變薄現(xiàn)象；模型組大鼠出現(xiàn)基底膜節(jié)段性不清甚至溶解、缺損，管腔縮??；中藥治療組、西藥治療組大鼠腦微管超微結(jié)構(gòu)的變化整體較糖尿病組有所改善?；谏鲜鼋Y(jié)果筆者認(rèn)為復(fù)元醒腦湯能降低糖尿病腦梗死大鼠模型的血糖水平，能夠上調(diào)血管內(nèi)皮CD31的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，改善腦微血管超微結(jié)構(gòu)，從而緩解糖尿病合并腦梗死進(jìn)展，改善大鼠神經(jīng)功能缺損行為評分，為臨床工作提供了重要參考，具有廣泛的應(yīng)用前景和非常重要的科學(xué)研究意義。