星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化鬧羊花中二萜的提取工藝△

孫婧，吳建華，宋藝君，戴洋

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

鬧羊花RhododendronmolleG.Don是著名有毒的杜鵑花屬植物[1]，其毒性成分主要包括梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素等二萜類化合物[2-3]。近代研究表明，二萜類化合物在抗腫瘤、抗菌、抗病毒等方面具有重要的醫(yī)用價值[4]。而目前主要的提取工藝為乙醇回流法[5]，但此法對樣品處理時有一定的局限性，如效率低下、受熱時間長、活性組分易被破壞等[6]。

隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，超聲波提取工藝由于成本低、效率高、周期短等優(yōu)勢[7]，在藥物、食品等學(xué)科門類中應(yīng)用廣泛[8-9]。針對超聲波提取二萜類物質(zhì)文獻報道甚少，因此本文采用該法提取鬧羊花中總二萜物質(zhì)，并結(jié)合星點設(shè)計法[10]對其工藝進行了優(yōu)化，得到了最佳的工藝條件。這既可作為提取鬧羊花中同類物質(zhì)的參照，又可為擴大實際生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100高效液相色譜儀(北京吉星達成科技有限公司)；KQ-50E型超聲波清洗器(廣州君達儀器儀表有限公司)；BP211D電子天平(德國Sartorius)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(河南天帝電子科技有限公司)；FW200型高速萬能粉碎機(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素由西北大學(xué)化工學(xué)院白乃生教授提供，純度大于99%；水為雙蒸水；乙醇；其余試劑均為分析純。

鬧羊花藥材，購于河北省某醫(yī)藥原料市場，經(jīng)白乃生教授鑒定為鬧羊花RhododendronmolleG.Don的花。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別稱取梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素對照品適量，然后加入60%(v%，下同)的乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，分別制成梫木毒素(質(zhì)量濃度為1.926 mg·mL-1)、木藜蘆毒素(質(zhì)量濃度為2.202 mg·mL-1)、鬧羊花素(質(zhì)量濃度為2.173 mg·mL-1)的對照品混合溶液備用。

2.2 樣品制備及提取實驗

影響鬧羊花二萜類化合物提取工藝的因素主要有溶劑種類、溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)。

理想且最為常用的溶劑種類包括甲醇、乙醇、丙酮等。而甲醇和丙酮有一定的毒性，因此選擇乙醇作為提取鬧羊花二萜類物質(zhì)的溶劑，并結(jié)合相關(guān)研究[11]選擇了60%的乙醇溶液。

將鬧羊花用粉碎機打碎后過40目篩，精密稱取粉末0.5 g，置于帶塞的錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL。因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，結(jié)合實際工業(yè)化生產(chǎn)，固定為2次[12]。在常規(guī)乙醇回流法和乙醇超聲法兩種工藝下各提取30 min，通過3組不同工藝的對比實驗確定最佳的提取方法，結(jié)果見表1。然后設(shè)置不同的料液比、提取溫度和提取時間進行單因素試驗。最后經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后取1 mL溶液，用60%乙醇定容于10 mL容量瓶中備用。

表1 不同提取方法對二萜提取量的影響 mg·g-1

由表1可知，采用常規(guī)乙醇回流法所得的鬧羊花中二萜提取量低于乙醇超聲工藝所得。這是因為超聲波是一種彈性波，振動產(chǎn)生較大的能量，有助于乙醇和二萜物質(zhì)的傳質(zhì)過程，最終增加了二萜的提取量[13]。因此選用乙醇超聲法作為最佳的提取工藝。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用液相色譜法得到了測定梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素含量的回歸方程，分別為Y1=37.14X1-2.18，r=0.999 9；Y2=62.39X2-4.26，r=0.999 8；Y3=56.82X3+1.35，r=0.999 9。擬合的相關(guān)系數(shù)r值均較高，可用于后續(xù)的分析測定。

2.4 精密度試驗

取對照品溶液于1 d內(nèi)連續(xù)進樣5次，計算梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素的峰面積，計算RSD(n=5)分別為1.64%、1.17%、0.59%。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取鬧羊花粉末5份，制備樣品溶液，測定峰面積，計算RSD(n=5)值分別為1.53%、1.15%、0.41%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取2.2.5的樣品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，記錄峰面積并計算RSD值為2.2%，表明供試樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知總二萜類化合物含量的同一鬧羊花粉末5份，每份0.5 g，各加入對照品溶液中含量相當(dāng)?shù)娜芤?，梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素的對照品按2.1制備，結(jié)果測得平均回收率為104.83%(n=5)。

3 二萜類化合物收率及含量測定

3.1 二萜類化合物含量測定

取2.1所得濾液，測定二萜類化合物的含量。

3.2 二萜類化合物收率測定

將2.1濾液濃縮后真空干燥，得浸膏粉，然后按照式(1)計算含量。

(1)

式中：Y表示二萜類化合物含量；C為總二萜類化合物質(zhì)量濃度；V為提取液體積；m為樣品質(zhì)量。

4 結(jié)果

4.1 單因素試驗

4.1.1 料液比對二萜提取量的影響 固定提取溫度為50 ℃，提取時間為40 min，研究不同料液比對二萜物質(zhì)提取量的影響規(guī)律，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對二萜物質(zhì)提取量的影響

由圖1可知，提取的二萜物質(zhì)提取量隨溶劑乙醇用量的增大呈先增后減的趨勢。當(dāng)料液比為1∶40時，二萜物質(zhì)的提取量達到最大。這是因為當(dāng)乙醇用量較小時，二萜物質(zhì)的提取量小，而乙醇用量過大時，提取出的二萜物質(zhì)可能部分被溶解破壞，導(dǎo)致含量略有降低。

4.1.2 提取溫度對二萜提取量的影響 固定料液比為1∶40，提取時間為40 min，研究不同提取溫度對二萜物質(zhì)提取量的影響規(guī)律，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對二萜物質(zhì)提取量的影響

由圖2可知，二萜物質(zhì)的提取量隨溫度的升高呈增大的趨勢，但增加趨勢逐漸減小。當(dāng)提取溫度為60 ℃時，二萜物質(zhì)提取量為59 mg·g-1，而當(dāng)溫度為70 ℃時二萜提取量僅增加了0.5 mg·g-1。由此可以看出，當(dāng)溫度高于60 ℃時，繼續(xù)增加溫度，對于二萜物質(zhì)提取量的增加并沒有實質(zhì)性作用，且當(dāng)溫度過高時，對于二萜類物質(zhì)也會造成一定的影響，綜合分析適宜的提取溫度為60 ℃。

4.1.3 提取時間對二萜提取量的影響 固定料液比為1∶40，提取溫度為60 ℃，研究不同的提取時間對二萜物質(zhì)提取量的影響規(guī)律，結(jié)果見圖3。

圖3 時間對二萜物質(zhì)提取量的影響

由圖3可知，二萜物質(zhì)的提取量隨提取時間的增大呈先增后減的趨勢。當(dāng)提取時間為40 min時，二萜物質(zhì)提取量達到最大值59 mg·g-1，此后隨著時間的增加，二萜物質(zhì)提取量逐漸減小，這可能是由于時間過長，溶出了更多的雜質(zhì)，降低了二萜物質(zhì)的提取量，這也與成英等[14]研究類似，因此適宜的提取時間為40 min。

4.2 星點設(shè)計優(yōu)化工藝

為了得到最佳的鬧羊花二萜類化合物提取工藝，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法對其進一步優(yōu)化，所用軟件為Design-Expert8.0。以料液比X1、提取溫度X2、提取時間X3為因素，以二萜提取量Y為響應(yīng)值，設(shè)計三因素五水平試驗方案。根據(jù)星點設(shè)計規(guī)則，任意兩個物理量的差值與對應(yīng)代碼之間成等比的原則，水平編碼分別取±1.68、±1和0，因素水平見表2。實驗方案設(shè)計及結(jié)果見表3，實驗方差分析見表4。

表2 星點設(shè)計各因素水平

表3 星點設(shè)計方案和結(jié)果

表4 方差分析表

由星點設(shè)計試驗經(jīng)響應(yīng)面二次模型分析法得到了料液比X1、提取溫度X2、提取時間X3對二萜提取量Y的回歸方程：

Y=63.68+0.15X1+5.00X2+0.33X3+

0.40X1X2+0.47X1X3+0.27X2X3-

由表4可看出，所擬合的模型方程顯著性小于0.000 1，說明上述回歸方程極為顯著。失擬誤差均大于0.05，說明不存在失擬因素。所以完全可以利用此回歸模型代替真實的實驗點來進行數(shù)據(jù)的比對和分析，結(jié)果亦是合理和可靠的。一次項系數(shù)X2的顯著性小于0.000 1，表現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但X1和X3的顯著性大于0.01，表明對二萜提取量影響不顯著，這是由于料液比和提取時間增大時，二萜類物質(zhì)的提取量達到了極限，此時二萜物質(zhì)幾乎完全被提取出，因此相較于提取溫度而言表現(xiàn)不顯著。此外由F值和顯著性的大小可知，對浸膏得率和二萜提取量影響因素的大小順序均為：提取溫度>提取時間>料液比。

根據(jù)實驗結(jié)合星點設(shè)計結(jié)果，得到各因素間交互作用的三維空間曲面圖和等高線圖，見圖4。

響應(yīng)曲面的起伏高度顯示了各因素對響應(yīng)值的影響大小，其關(guān)系成正比。即曲面起伏高度越陡，該因素對響應(yīng)值影響越明顯。等高線密集成橢圓表示兩因素交互作用大，而成圓形時表明交互作用小。所以通過圖4的比較，對二萜提取量影響最大的因素是提取溫度，最小的為料液比。這與上述方差分析表得出的結(jié)論也是一致的。

通過對各因素的優(yōu)化，得到了最佳的鬧羊花二萜類化合物提取工藝條件：料液比為1∶40.29，提取溫度為63.15 ℃，提取時間為40.53 min。預(yù)測最大的鬧羊花二萜提取量為65.27 mg·g-1。

4.3 可靠性驗證

為了驗證星點設(shè)計試驗的可靠性，考慮到實際情況，微調(diào)了最佳工藝，進行3組驗證試驗，得到了鬧羊花二萜提取量分別為63.92%、64.78%和62.85%，這與星點設(shè)計預(yù)測值的相對誤差在5%以內(nèi)，說明了星點設(shè)計試驗方案可靠，結(jié)果較為準(zhǔn)確。

5 結(jié)論

采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對鬧羊花中二萜物質(zhì)的提取工藝進行了優(yōu)化，得到了鬧羊花二萜的最優(yōu)提取工藝條件：料液比1∶40.29，提取溫度63.15 ℃，提取時間40.53 min。預(yù)測最大的鬧羊花二萜提取量為65.27 mg·g-1，并通過實驗驗證了星點設(shè)計方案的合理性與可靠性。所以該工藝條件既可為后期提取鬧羊花中同類物質(zhì)作參照，又可為擴大實際生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持和參考價值。

注：A.料液比和提取溫度對二萜提取量的交互作用；B.料液比和提取時間對二萜提取量的交互作用；C.提取溫度和提取時間對二萜提取量的交互作用。圖4 各因素交互作用三維曲面圖