膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5在消化道疾病中的研究進(jìn)展

巢佳燈，秦錫虎

(1.南京醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南京 210029； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇 常州 213000)

膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5(takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5)也被稱(chēng)為GPBAR1, M-BAR以及BG37。TGR5由330個(gè)氨基酸組成，是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員，包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，基因位于小鼠染色體1C3及人體染色體2q35[1]。在靜息狀態(tài)下，TGR5由α、β及γ亞基組成，一旦與膽汁酸結(jié)合后，分離的α蛋白亞基激活腺苷酸環(huán)化酶，將ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)腺苷酸從而激活下游通路。

TGR5表達(dá)廣泛，包括肝臟、膽囊、胰腺、胃腸及腎臟等全身多處組織均能檢測(cè)到TGR5信使RNA，其中脾臟和胎盤(pán)表達(dá)量最高[2]。膽汁酸是TGR5的內(nèi)源性天然激動(dòng)劑，包括初級(jí)膽汁酸(膽酸和鵝脫氧膽酸)和次級(jí)膽汁酸(脫氧膽酸和石膽酸及其與甘氨酸、?；撬岬慕Y(jié)合物)，其中石膽酸的激動(dòng)性最強(qiáng)，脫氧膽酸次之，且鵝脫氧膽酸及膽酸的激動(dòng)性依次下降[3]。TGR5激活后具有多種生物學(xué)功能，目前已證實(shí)，TGR5在調(diào)節(jié)糖類(lèi)、脂類(lèi)、能量代謝、膽汁代謝以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并且參與胃腸腫瘤、肝膽疾病和炎性腸病等多種消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生，其激動(dòng)劑或抑制劑可能是治療這些疾病的潛在藥物?，F(xiàn)對(duì)TGR5在不同消化道疾病及其信號(hào)通路中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 TGR5與食管癌

TGR5與胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但對(duì)于食管癌及其癌前病變作用的研究較少。對(duì)不同類(lèi)型食管組織行免疫組織化學(xué)檢測(cè)的研究表明，TGR5在食管腺癌與癌前病變組織中的表達(dá)明顯高于巴雷特食管和正常食管，表明TGR5可能在食管腺癌的發(fā)生中起作用[4]。Li和Cao[5]發(fā)現(xiàn)，TGR5可能引起DNA雙鏈斷裂造成DNA損傷，持久的雙鏈斷裂可導(dǎo)致染色體異常，包括易位和缺失，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。通過(guò)?；敲撗跄懰峤閷?dǎo)的FLO-1食管腺癌細(xì)胞DNA損傷的研究表明，TGR5過(guò)表達(dá)可顯著增加尾矩(一種定量判斷DNA損傷程度的方法)和組蛋白H2AX的磷酸化(已被證明是雙鏈DNA斷裂的標(biāo)志)，而基因敲除FLO-1細(xì)胞內(nèi)尾矩和H2AX的磷酸化則大大減少，由此推測(cè)，TGR5可介導(dǎo)食管腺癌細(xì)胞的DNA損傷，從而引起腺癌的發(fā)生。Abu-Farsakh等[6]發(fā)現(xiàn)，Claudin-2是一種獨(dú)特的Claudin蛋白，位于鱗狀細(xì)胞和腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，可在細(xì)胞緊密連接處形成陽(yáng)離子與水的選擇性細(xì)胞旁路通道，增加細(xì)胞間的通透性，這些改變影響了食管上皮細(xì)胞的微環(huán)境，最終可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞化生甚至癌變。Claudin-2蛋白在正常鱗狀黏膜、柱狀細(xì)胞化生(巴雷特食管)、輕度異型增生、重度異型增生和食管腺癌中的表達(dá)量不同，隨著細(xì)胞異型性程度的加深，Claudin-2的表達(dá)量也不斷增加，并且與TGR5的表達(dá)呈正相關(guān)，但染色強(qiáng)度、臨床分期、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與TGR5無(wú)關(guān)，可見(jiàn)TGR5可能不是判斷腺癌預(yù)后的指標(biāo)，但可能是巴雷特食管向重度不典型增生和腺癌進(jìn)展的潛在標(biāo)志[7]。

多項(xiàng)研究表明，TGR5可能會(huì)導(dǎo)致食管腺癌的發(fā)生，但均存在一定的局限性[8-11]。目前，研究主要依靠體外細(xì)胞或免疫組織化學(xué)，尚缺乏直接的證據(jù)證明TGR5會(huì)導(dǎo)致食管腺癌，TGR5與食管腺癌的具體機(jī)制也尚不清楚。進(jìn)一步研究TGR5激動(dòng)劑與拮抗劑的動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)，將有助于了解TGR5與食管腺癌的相關(guān)機(jī)制。

2 TGR5與胃癌

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，早期診斷較為困難，預(yù)后相對(duì)較差，主要依靠淋巴結(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。胃癌的發(fā)生是多種因素共同參與逐步形成的過(guò)程，研究TGR5與胃癌之間的關(guān)系，將有助于胃癌的診斷和治療。

JAK激酶(janus kinase，JAK)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)形成的信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡中起重要作用，尤其是STAT3。STAT3是一種致癌基因，其作用于下游Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1、細(xì)胞周期蛋白D1、原癌基因蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等靶基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗凋亡蛋白的上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[12-13]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默STAT3也反向證明了抑制STAT3可抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤凋亡[14]。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)，TGR5的激活可在體內(nèi)外通過(guò)拮抗STAT3的磷酸化和DNA的結(jié)合活性強(qiáng)烈抑制STAT3信號(hào)通路?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是重要的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和侵襲的調(diào)節(jié)因子，Guo等[16]報(bào)道，TGR5激活后可抑制胃癌細(xì)胞的MMP-2、MMP-7和MMP-14基因的表達(dá)，并同時(shí)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，TGR5阻斷STAT3信號(hào)通路可能是抑制MMP眾多機(jī)制中的一種。因此，TGR5是胃癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制因子，它的激活抑制了STAT3信號(hào)通道，表明TGR5配體在抗胃癌中具有一定的潛在價(jià)值。

TGR5致胃癌可能與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2有關(guān)。脫氧膽酸能在肝臟、膽汁和胃等多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化，從而促進(jìn)ERK1/2的快速激活。為證明肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子在脫氧膽酸介導(dǎo)的EGFR-ERK1/2中起作用，Yasuda等[17]使用抗表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子的中和抗體預(yù)處理人胃癌AGS細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，缺乏表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子可阻斷脫氧膽酸誘導(dǎo)EGFR磷酸化和ERK1/2的激活；隨后，通過(guò)沉默TGR5證明，脫氧膽酸誘導(dǎo)AGS細(xì)胞中EGFR的激活與膽汁酸受體TGR5的活性有關(guān)。EGFR能促進(jìn)環(huán)加氧酶2在胃腸細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，環(huán)加氧酶2是一種由花生四烯酸促進(jìn)合成的前列腺素，可在許多癌癥細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、加快血管生成引起上皮細(xì)胞的癌變。TGR5可能通過(guò)去整合素和金屬蛋白酶/肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子-EGFR-ERK1/2通路促進(jìn)環(huán)加氧酶2的表達(dá)，最終引起胃細(xì)胞癌變。

3 TGR5與肝損傷

目前，肝損傷方面TGR5的研究較少。肝臟中的TGR5主要分布于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)并減輕肝臟損傷，為肝臟提供良好的再生環(huán)境[18]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中的TGR5受刺激后可激活并上調(diào)一氧化氮合酶，調(diào)節(jié)肝竇血流，具體機(jī)制為T(mén)GR5劑量依賴(lài)性地升高環(huán)腺苷酸，從而導(dǎo)致蛋白激酶A的激活，使內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，誘導(dǎo)一氧化氮的合成，一氧化氮是體內(nèi)重要的細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，是一種特殊的自由基清除劑，在缺血再灌注損傷后可起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用[19-20]。在巨噬細(xì)胞中，TGR5通過(guò)抑制核因子κB信號(hào)通路，降低細(xì)胞吞噬活性并減少促炎因子[21]。庫(kù)普弗細(xì)胞內(nèi)TGR5的激活可有效減少多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)和分泌，抑制細(xì)胞的吞噬和遷移，觸發(fā)抗炎巨噬細(xì)胞表型的形成，從而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的目的[22]。Keitel和H?ussinger[19]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，庫(kù)普弗細(xì)胞上的TGR5可有效地降低脂多糖引起腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β、IL-1以及IL-6等細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)，特點(diǎn)是下調(diào)諸多炎性因子，但I(xiàn)L-10除外。研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽可介導(dǎo)TGR5抑制Nod樣受體蛋白3炎性小體的激活，隨后通過(guò)蛋白激酶A誘導(dǎo)骨髓源性巨噬細(xì)胞中Nod樣受體蛋白3炎性小體的磷酸化和泛素化，促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放[23]。此外，Ding等[24]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGR5通路在小鼠垂直袖狀胃切除術(shù)后發(fā)揮抗肥胖、降血糖和改善脂肪肝的作用。野生小鼠在垂直袖狀胃切除術(shù)后2周體脂含量顯著下降，而TGR5基因敲除鼠在垂直袖狀胃切除術(shù)后2周體脂未發(fā)生明顯改變。垂直袖狀胃切除術(shù)術(shù)后野生小鼠體內(nèi)TGR5表達(dá)量明顯增加，肝臟炎性因子及三酰甘油水平降低，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性下降，由此可見(jiàn)，TGR5表達(dá)量的增加可起到減輕肝臟炎癥、保護(hù)肝功能的作用。此外，肝內(nèi)膽管細(xì)胞中的TGR5也對(duì)改善細(xì)胞損傷起重要作用，主要分布于頂端質(zhì)膜及纖毛中，可促進(jìn)氯離子的分泌，促進(jìn)細(xì)胞增殖。TGR5可在部分肝切除術(shù)后保護(hù)肝臟，防止膽汁酸過(guò)載，并可能具有多重促進(jìn)再生的機(jī)制[25]。首先，TGR5可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)起到抗炎作用。其次，TGR5可能有助于調(diào)節(jié)部分肝切除術(shù)后膽汁酸的成分。有文獻(xiàn)報(bào)道，TGR5可調(diào)控不同上皮細(xì)胞中囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)物，增加膽道碳酸氫根離子和氯離子的輸出，促進(jìn)膽汁分泌和流動(dòng)，從而保護(hù)剩余肝細(xì)胞免受過(guò)載膽汁酸的毒性作用[26]。最后，膽汁酸疏水性的改變可導(dǎo)致肝臟損害，有研究表明，代謝紊亂所致膽汁疏水性增強(qiáng)將抑制肝臟再生，而TGR5基因敲除鼠的膽汁組分較野生鼠的疏水化更強(qiáng)，過(guò)度疏水的膽汁酸淤積于肝內(nèi)可能是基因敲除鼠肝臟損害的重要原因之一，但TGR5控制膽汁疏水性的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 TGR5與肝癌

肝癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，男性肝癌發(fā)生率在全球位列第五，女性位列第七，肝細(xì)胞性肝癌是最主要的組織學(xué)亞型，占全球肝癌發(fā)病率的70%～85%[27]。目前，對(duì)于肝癌的篩查和檢測(cè)主要依靠血清甲胎蛋白和B超，甲胎蛋白缺乏具有足夠的敏感性和特異性，而B(niǎo)超檢查的結(jié)果則受到諸多因素的影響。DNA甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳機(jī)制，通過(guò)向DNA中添加甲基來(lái)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，大多數(shù)惡性腫瘤均能發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因發(fā)生異常甲基化的現(xiàn)象。啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是癌變過(guò)程早期的重要表現(xiàn)，甲基化DNA也被認(rèn)為是早期篩查癌癥的潛在生物標(biāo)志物。Han等[28]首次發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞性肝癌患者血清中存在異常甲基化的TGR5啟動(dòng)子，并且老年患者甲基化的頻率明顯增高。因此，血清TGR5啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)可作為一種潛在的肝癌篩查手段，與甲胎蛋白聯(lián)合應(yīng)用可提高肝細(xì)胞性肝癌的診斷率。

Chen等[15]強(qiáng)調(diào)TGR5作為肝癌抑制因子，可能通過(guò)二乙基亞硝胺介導(dǎo)肝癌的產(chǎn)生，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGR5基因敲除鼠對(duì)于二乙基亞硝胺引起的肝損傷和癌變更為敏感，對(duì)出生1個(gè)月基因敲除鼠單獨(dú)注射二乙基亞硝胺，早期肝損傷較重，出現(xiàn)強(qiáng)烈的代償性增殖和細(xì)胞因子急性惡變，經(jīng)過(guò)8個(gè)月的二乙基亞硝胺處理，大部分TGR5基因敲除鼠產(chǎn)生肝臟腫瘤，而野生小鼠則未出現(xiàn)，隨后，通過(guò)肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，TGR5可能是通過(guò)阻斷STAT3信號(hào)通路抑制肝癌的發(fā)生。

TGR5對(duì)肝臟保護(hù)具有重要作用，TGR5的激活也可促進(jìn)多囊肝病囊腫的生長(zhǎng)以及惡性轉(zhuǎn)化膽管細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用，促進(jìn)膽管癌的進(jìn)展，故需根據(jù)肝臟疾病的類(lèi)型選擇刺激或抑制TGR5，可作為一種潛在的治療方案。

5 TGR5與膽囊結(jié)石

目前尚無(wú)任何直接證據(jù)證明TGR5能促進(jìn)膽囊結(jié)石形成，但TGR5可促進(jìn)膽囊充盈，存在結(jié)石的膽囊中TGR5的信使RNA表達(dá)量也明顯升高。TGR5在人和嚙齒動(dòng)物的膽囊中主要分布于上皮和平滑肌細(xì)胞，尤其在膽囊上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛和細(xì)胞膜頂端[29]。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石患者膽囊黏膜上TGR5的表達(dá)明顯增強(qiáng)，通過(guò)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A通路介導(dǎo)尖端鈉依賴(lài)性膽鹽運(yùn)輸體調(diào)控膽汁酸的重吸收，待血清膽汁酸水平升高后，進(jìn)而反饋性地抑制膽汁酸的合成，造成膽汁中膽固醇水平升高，但膽汁酸濃度卻降低，從而維持膽汁的過(guò)飽和狀態(tài)，促進(jìn)膽囊結(jié)石的形成；其次，TGR5高表達(dá)可使膽汁合成限速酶Cyp7a1的信使RNA表達(dá)下降，協(xié)同抑制膽汁酸合成[30-31]。致石飲食喂養(yǎng)TGR5敲除鼠，盡管小鼠存在膽囊動(dòng)力障礙，但仍能有效防止膽固醇結(jié)石的產(chǎn)生，說(shuō)明TGR5的缺乏改變了膽汁酸的合成反饋[20]。實(shí)驗(yàn)證明，TGR5基因敲除鼠的膽囊容量較野生鼠小，且不隨膽汁喂養(yǎng)而增大，而野生鼠在喂養(yǎng)TGR5激動(dòng)劑后則出現(xiàn)不同程度的膽囊充盈，這種改變與基因敲除鼠膽囊平滑肌的松弛有關(guān)，且小鼠膽汁酸池也較野生鼠小[31]。TGR5可促進(jìn)膽囊充盈，因此TGR5激動(dòng)劑的使用可能會(huì)導(dǎo)致不必要的不良反應(yīng)，并可能成為限制治療藥物使用的原因。

6 TGR5與炎癥性腸病

腸道中TGR5主要集中表達(dá)于回腸與結(jié)腸單核細(xì)胞內(nèi)，起到抑制腸道炎癥、保護(hù)腸道黏膜屏障和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖的作用，但在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚，已知染色體2q35位點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎和硬化性膽管炎的發(fā)病有關(guān)，且該位點(diǎn)與TGR5關(guān)系密切。

實(shí)驗(yàn)證明，TGR5具有維持腸道黏膜屏障完整性的功能[32]。TGR5基因敲除鼠結(jié)腸組織表現(xiàn)出黏液細(xì)胞的分布與動(dòng)力學(xué)改變，促進(jìn)激活的巨噬細(xì)胞聚集于結(jié)腸固有層，加重組織炎癥，同時(shí)結(jié)腸緊密連接的分子結(jié)構(gòu)(Zonulin-1蛋白和Occludin蛋白)也出現(xiàn)破壞，造成腸道黏膜通透性增加，并隨小鼠年齡增長(zhǎng)而加重[33]。與此同時(shí)，TGR5的缺失會(huì)促成炎癥性腸病的發(fā)生。使用腸黏膜屏障阻斷劑后，與同類(lèi)相比，TGR5敲除鼠更容易患結(jié)腸炎。Jia等[11]通過(guò)免疫組織化學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，12%的腸上皮化生患者出現(xiàn)TGR5高表達(dá)。腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞可分為M1和M2兩種亞型，M1多與促炎因子相關(guān)，如IL-1、IL-6、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子，從而激活Th1和Th17細(xì)胞，其中IL-12通過(guò)γ干擾素產(chǎn)物激活Th1細(xì)胞；M2負(fù)責(zé)介導(dǎo)抗炎與免疫抑制作用，主要產(chǎn)生IL-10,誘導(dǎo)激活調(diào)節(jié)T細(xì)胞，IL-10可減少腫瘤壞死因子，γ干擾素和IL-6等炎性因子。當(dāng)TGR5被激活時(shí)，IL-10/IL-12比例增加，說(shuō)明M2型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位。TGR5激動(dòng)劑在炎癥性腸病的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中表現(xiàn)出控制炎癥的能力，但尚缺乏臨床試驗(yàn)[34-35]?？梢?jiàn)，TGR5激動(dòng)劑具有治愈炎癥性腸病的潛在價(jià)值。

7 小 結(jié)

近年來(lái)，關(guān)于TGR5研究逐漸增多，為進(jìn)一步了解其作用機(jī)制提供了幫助。TGR5作為信號(hào)分子，廣泛表達(dá)于全身各處組織，通過(guò)第二信使激活各種信號(hào)通路，不同組織中TGR5的分子作用機(jī)制不同，仍有待進(jìn)一步研究。TGR5在調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞再生等方面發(fā)揮重要的生理功能，有望成為各類(lèi)相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。