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    紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)高尿酸血癥模型小鼠的降尿酸作用

    2019-02-25 02:02:42袁冬寅肖文軍彭影琦林玲周陽譚春波譚洪波龔志華
    茶葉科學(xué) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:別嘌呤醇花紅磚茶

    袁冬寅,肖文軍,3,彭影琦,林玲,周陽,譚春波,譚洪波,龔志華*

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2. 湖南武陵秀峰茶業(yè)有限公司,湖南 常德 415000;3. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128

    高尿酸血癥(hyperuricemic,HUA)是由嘌呤代謝絮亂導(dǎo)致機(jī)體尿酸水平超出正常范圍的一種生理現(xiàn)象[1]。機(jī)體內(nèi)尿酸生成增多和/或排泄減少是導(dǎo)致HUA的主要原因[2],降低尿酸代謝過程中的關(guān)鍵酶活性是防治HUA重要的切入點(diǎn)。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)和腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)是尿酸合成過程中的關(guān)鍵酶,可通過抑制其活性來降低體內(nèi)尿酸水平并達(dá)到緩解HUA的效果[3]。研究表明,HUA不僅是痛風(fēng)的并發(fā)癥,而且還會(huì)引發(fā)高血壓、冠心病、糖尿病等[1,4]。

    紅茶是六大茶類中的全發(fā)酵茶,含有茶黃素、茶紅素等品質(zhì)和功能成分,具有治療心腦血管疾病、降脂減肥、預(yù)防神經(jīng)退行性疾病等[5-9]的多種生物活性作用。朱創(chuàng)等[6]研究表明,紅茶提取物能抑制肝臟XOD活性,減少尿酸生產(chǎn)。隨著近年對(duì)茯磚茶在減肥、降血脂、抗氧化、抗腹瀉、保肝護(hù)肝等健康功能方面研究的深入[10-14],在發(fā)現(xiàn)普洱熟茶具有降低高尿酸模型小鼠尿酸的作用之后,又發(fā)現(xiàn)金花散茶也能通過抑制肝臟XOD、ADA活性而減輕HUA的癥狀[15-16]。發(fā)花紅磚茶是在紅茶的基礎(chǔ)上增加了發(fā)花、壓制等工藝的一種紅茶新產(chǎn)品,是否比其紅茶具有更好的降尿酸作用尚有待進(jìn)一步探究。本研究以相同鮮葉加工而成的紅茶及其發(fā)花紅磚茶為原料,以高尿酸血癥小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象,探究發(fā)花紅磚茶是否具有降尿酸作用,比較紅茶及其發(fā)花紅磚茶的降尿酸效果,為發(fā)花紅磚茶的生產(chǎn)與消費(fèi)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

    1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)KM小鼠90只,雄性,(20±2)g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002。

    1.1.2 材料

    紅茶及發(fā)花紅磚茶均由湖南武陵秀峰茶業(yè)有限公司生產(chǎn)加工。紅茶是由碧香早一芽三四葉經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工藝加工而成;發(fā)花紅磚茶是在紅茶的基礎(chǔ)增加了發(fā)花、壓制等工藝加工而成。

    1.1.3 試劑

    氧嗪酸鉀(PO)購(gòu)于上海阿拉丁,純度≥98%;別嘌呤醇片購(gòu)于上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;尿酸、尿素氮、肌酐、XOD、ADA試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

    1.1.4 儀器設(shè)備

    多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)、MIKRO22R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó) Hettich 公司)、電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、冷凍干燥機(jī)(廣州三元科技有限公司)、PowerGen 125高速勻漿機(jī)(中國(guó)賽默飛世爾科技公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)、紫外分光光度計(jì)UV-2550(日本島津公司)等。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 茶樣前處理方法

    稱取加工原料嫩度一致的紅茶和發(fā)花紅磚茶各600 g,分別粉碎后,按茶水比1∶10在沸水浴中提取 30 min,浸提 2次,過濾,合并濾液于55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至固態(tài)物含量約30%后,冷凍干燥分別得干粉143.50 g與 147.70 g,鋁箔袋收集干粉,放入冰箱保存。經(jīng)檢測(cè),紅茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡(jiǎn)單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素含量分別為31.30%、10.24%、1.30%、1.69%、3.29%、1.55%、19.61%、22.67%。發(fā)花紅磚茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡(jiǎn)單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量分別為30.90%、11.44%、1.61%、1.19%、2.80%、1.22%、19.18%、29.70%。

    1.2.2 HUA小鼠模型的方法建立

    20只SPF級(jí)KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,稱重,隨機(jī)分為正常組(NC)、模型組(MC),每組10只。第8天上午,模型組灌喂250 mg·kg-1的PO(用0.50% CMC-Na溶液懸?。┻M(jìn)行造模[15],灌喂體積為每 10 g體質(zhì)量 0.1mL,正常組灌喂等體積的0.50% CMC-Na溶液,連續(xù)7 d,并在第14天灌喂處理1 h后,2組小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉,摘眼球取血,每組采血時(shí)間不超過5 min。血液室溫靜置、離心取血清檢測(cè)血尿酸(SUA)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。根據(jù)文獻(xiàn)[6],當(dāng)模型組SUA水平顯著高于空白組時(shí),說明造模成功,當(dāng)BUN和/或SCr水平顯著高于空白組時(shí),說明PO可能對(duì)腎臟造成損傷,并由此來建立HUA小鼠模型的方法。

    1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以建立的HUA小鼠模型方法為基礎(chǔ),將90只 SPF級(jí) KM小鼠在 22~25℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d后,稱體質(zhì)量,隨機(jī)分為正常組(NC)、模型組(MC)、紅茶高劑量組(BH)、紅茶中劑量組(BM)、紅茶低劑量組(BL)、發(fā)花紅磚茶高劑量組(FBH)、發(fā)花紅磚茶中劑量組(FBM)、發(fā)花紅磚茶低劑量組(FBL)、別嘌呤醇組(AP),每組10只。按參考文獻(xiàn)[15,17],確定別嘌呤醇劑量為 20 mg·kg-1·d-1,按1.2.1處理所得的茶粉高、中、低劑量分別為 2 g·kg-1·d-1、1 g·kg-1·d-1、0.50 g·kg-1·d-1。第8天至第14天期間,除正常組之外,其余各組按1.2.2所述方法每天定時(shí)灌喂PO進(jìn)行造模,同時(shí)正常組灌喂等體積的 0.50%CMC-Na溶液。第15天至第28天期間,在正常組與其余各組分別灌喂等體積的 0.50%CMC-Na和PO 1 h后,別嘌呤醇組與給茶組分別灌喂相應(yīng)劑量的別嘌呤醇和茶水提取物(均溶解于6 mL水中),正常組與模型組均灌喂等體積的水,灌喂體積為每 10 g體質(zhì)量0.1 mL;第26天,用代謝籠收集24 h的尿液;第28天,各組灌喂給藥1 h后,每只小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉,摘眼球取血,每組采血時(shí)間不超過5 min,并解剖肝臟、腎臟組織。

    1.3 檢測(cè)方法

    1.3.1 小鼠體質(zhì)量與器官指數(shù)測(cè)定

    每天稱每組小鼠總體質(zhì)量,隔日稱每只小鼠體質(zhì)量。

    將小鼠肝臟與腎臟于 4℃的生理鹽水洗凈血漬,濾紙吸干表面水分后稱其濕重。

    器官指數(shù)(%)=器官質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。

    1.3.2 血尿酸、血尿素氮、血肌酐含量測(cè)定

    采血后室溫靜置1 h,4℃下3 000 r·min-1離心 10 min,取血清,按試劑盒測(cè)定 SUA、BUN、SCr含量。

    1.3.3 尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐含量測(cè)定

    新鮮尿液以 3 000 r·min-1離心 15 min,去沉渣,取上清液,按試劑盒測(cè)定UUA、UUN、UCr含量。

    1.3.4 肝臟組織中XOD和ADA活性測(cè)定

    將肝臟組織按質(zhì)量(g)在預(yù)冷的生理鹽水體積(mL)為1∶9比例下,在冰水浴中混合,再用組織勻漿機(jī)制成 10%勻漿,2 500 r·min-1離心10 min,小心除去脂質(zhì)層,取上清液按試劑盒測(cè)定XOD及ADA活性。

    1.3.5 茶粉品質(zhì)成分檢測(cè)

    茶多酚總量的檢測(cè)采用 GB/T 8313—2008方法;咖啡堿、兒茶素的含量檢測(cè)采用HPLC法[15];茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量檢測(cè)采用紫外比色法[18]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;二組間的差異采用t檢測(cè),多組間比較用單因素方差分析,考察各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HUA小鼠模型方法的建立

    血肌酐水平是評(píng)價(jià)機(jī)體腎功能的重要指標(biāo),腎功能損傷導(dǎo)致肌酐排泄障礙,從而引起機(jī)體肌酐水平的升高。表1表明,與正常組相比,小鼠連續(xù)7 d灌喂250 mg·kg-1PO進(jìn)行造模后,盡管模型組與正常組的BUN水平無顯著性差異(P>0.05),但 SUA、SCr水平顯著升高(P<0.05),其中SUA比正常組升高了52.30%,說明造模成功。

    2.2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì) HUA模型小鼠的降尿酸作用

    2.2.1 對(duì)體質(zhì)量與器官指數(shù)的影響

    由表 2可知,整個(gè)試驗(yàn)過程中,各組小鼠體質(zhì)量均有所增加。正常組與模型組相比,體質(zhì)量增加量無顯著差異,說明灌喂 PO未對(duì)體質(zhì)量造成影響。8~20 d給藥期間,與模型組相比,給茶組體質(zhì)量均顯著降低(P<0.05),這可能與紅茶、發(fā)花紅磚茶具有降脂減肥作用有關(guān)。

    表3顯示,與正常組相比,模型組肝臟、腎臟指數(shù)均有所上升,其中肝臟指數(shù)達(dá)顯著水平(P<0.05)。與模型組相比,給茶組肝臟、腎臟指數(shù)均降低,其中除紅茶低劑量組之外,其他給茶組的腎臟指數(shù)達(dá)顯著水平(P<0.05),同時(shí)兩種茶對(duì)應(yīng)劑量組之間均無顯著差異。與別嘌呤醇組相比,除紅茶低劑量組之外,其他給茶組的腎臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。說明紅茶及其發(fā)花紅磚茶具有降低HUA小鼠肝臟、腎臟指數(shù)的作用。

    2.2.2 對(duì)小鼠血尿酸、血尿素氮和血肌酐的影響

    圖1表明,與正常組相比,模型組小鼠的SUA、BUN、SCr水平均極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,別嘌呤醇組的 SUA、BUN、SCr水平顯著降低(P<0.05),其中SUA、SCr達(dá)極顯著水平(P<0.01)。灌喂二種茶均能降低HUA小鼠SUA、BUN、SCr水平,其中,發(fā)花紅磚茶中、高劑量組在降低 SUA的效果上比紅茶更好。與模型組相比,紅茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低13.69%、16.58%、17.92%(P<0.05),發(fā)花紅磚茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低14.67%(P<0.05)、24.44%(P<0.01)、26.43%(P<0.01);同時(shí)二種茶均能極顯著降低 BUN、SCr水平(P<0.01),且均優(yōu)于別嘌呤醇組;發(fā)花紅磚茶低劑量組在降低BUN的效果上比紅茶更好,而二種茶在降低SCr方面則無顯著差異。由此提示紅茶和發(fā)花紅磚茶均具有保護(hù)HUA小鼠腎臟的作用。

    表1 灌喂氧嗪酸鉀對(duì)小鼠SUA、BUN及SCr水平的影響Table 1 Effects of potassium oxonate on serum uric acid,BUN and serum creatinine levels in mice

    表2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)HUA小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of black tea and its flower brick tea on the weight changes of hyperuricemic mice

    表3 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)HUA小鼠器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of black tea and its flower brick tea on organs index of hyperuricemic mice

    2.2.3 對(duì)小鼠尿尿酸、尿尿素氮和尿肌酐的影響

    從圖2可以看出,與正常組比較,模型組的 UUA、UUN、UCr水平均極顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,別嘌呤醇組的UUA、UUN、UCr均極顯著升高(P<0.01),紅茶及發(fā)花紅磚茶各劑量組的 UUA、UUN、UCr水平均不同程度升高,其中高劑量組的 UUA以及中、高劑量組的 UUN、UCr達(dá)極顯著水平(P<0.01),此外,紅茶中劑量組的UUA以及低劑量組的UCr達(dá)顯著水平(P<0.05),發(fā)花紅磚茶低劑量組的UCr達(dá)極顯著水平(P<0.01)。與紅茶各劑量組相比,發(fā)花紅磚茶高劑量組在升高UUA、UUN、UCr的水平上以及中、低劑量組分別在升高UUN與UCr水平上優(yōu)于紅茶。與別嘌呤醇組相比,二種茶中劑量組及發(fā)花紅磚茶高劑量組、二種茶高劑量組分別在升高 UUN、UCr水平方面作用效果優(yōu)于別嘌呤醇組。

    圖1 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)HUA小鼠SUA、BUN和SCr水平的影響Fig. 1 Effects of black tea and its flower brick tea on serum uric acid,BUN,serum creatinine levels in hyperuricemic mice

    2.2.4 對(duì)小鼠肝臟組織 XOD和 ADA活性的影響

    圖 3表明,模型組小鼠肝臟組織中的XOD、ADA活性與正常組相比,均極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,別嘌呤醇組的 XOD、ADA活性分別降低了 23.13%、18.96%,差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01);紅茶及發(fā)花紅磚茶各劑量組的XOD、ADA活性均不同程度降低,其中,中、高劑量組達(dá)顯著水平(P<0.05),發(fā)花紅磚茶高劑量及紅茶中、高劑量達(dá)極顯著水平(P<0.01),同時(shí)二種茶對(duì)應(yīng)劑量組之間無顯著差異。

    圖2 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)HUA小鼠尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平的影響Fig. 2 Effects of black tea and its flower brick tea on urine uric acid,urine urea nitrogen and urine creatinine levels in hyperuricemic mice

    圖3 紅茶及其發(fā)花紅磚茶對(duì)HUA小鼠肝臟組織XOD和ADA活性的影響Fig. 3 Effects of black tea and its flower brick tea on XOD and ADA activities in hyperuricemic mice

    3 結(jié)論與討論

    尿酸是由嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶、XOD等作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,大多可通過肝臟尿素酶作用降解為尿囊素隨尿液排出。正常情況下,機(jī)體中的尿酸生成與排泄基本保持動(dòng)態(tài)平衡,但當(dāng)血尿酸產(chǎn)生過多和(或)分泌過少均可引發(fā)高尿酸血癥[19-20]。PO是一種尿酸酶抑制劑,可特異性阻斷尿酸降解為尿囊素,從而提高血尿酸水平。因此,在高尿酸血癥的試驗(yàn)研究中PO已被廣泛應(yīng)用于高尿酸血癥的造模[16]。

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,紅茶及其發(fā)花紅磚茶各劑量組的體質(zhì)量增加量、腎臟指數(shù)及SUA水平均顯著降低,UUA水平則不同程度升高,且對(duì)SUA、UUA的作用效果具有劑量效應(yīng);同時(shí)二種茶均能極顯著降低血清中尿素氮、肌酐水平,作用效果優(yōu)于別嘌呤醇,還提高尿液中尿素氮、肌酐水平,說明紅茶及其發(fā)花紅磚茶均對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。這可能與二種茶含有一定量的茶多酚、咖啡堿、茶黃素等活性較強(qiáng)的物質(zhì)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),茶多酚中EC、EGC、ECG對(duì)高尿酸血癥小鼠具有降尿酸作用,而 EGCG對(duì)高尿酸血癥小鼠無顯著降尿酸作用[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與紅茶各劑量組相比,發(fā)花紅磚茶高劑量組在降低血尿酸、提高尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平等方面均優(yōu)于紅茶。這可能是發(fā)花紅磚茶在發(fā)花工藝過程由于冠突散囊菌等微生物的參與而使像酯型兒茶素EGCG這類物質(zhì)部分發(fā)生水解,轉(zhuǎn)變成簡(jiǎn)單兒茶素和沒食子酸,為其降尿酸奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[22],也有可能是在后發(fā)酵過程中由兒茶素、茶黃素或茶紅素進(jìn)一步氧化聚合所致。

    XOD是尿酸生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶,是抗高尿酸血癥藥的良好靶點(diǎn),能催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸和超氧離子,XOD活性或濃度增加是尿酸生成增多的主要原因[2]。ADA在嘌呤代謝和腺苷平衡中起重要作用,能催化2-脫氧腺苷和腺苷水解脫氨,腺嘌呤核苷脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷,間接影響尿酸的生成[23]。PO誘導(dǎo)的 HUA小鼠會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化能力明顯減弱,過高尿酸水平會(huì)造成細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓不平衡,引起多種酶活性發(fā)生改變。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與模型組相比,給茶組均能不同程度降低XOD、ADA活性,減少尿酸的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn),酚類和黃酮類等物質(zhì)能抑制XOD活性。因?yàn)檫@些活性物質(zhì)含有酚羥基結(jié)構(gòu),具有較強(qiáng)的抗氧化、清除氧自由基的作用,而且茶多酚還能降低細(xì)胞質(zhì)膜被氧化,保護(hù)組織免受過氧化的破壞。因此推測(cè)紅茶及其發(fā)花紅磚茶能抑制XOD活性與這二種茶含有一定量的酚類和黃酮類物質(zhì)有關(guān)[15,21,24-25]。但是,目前對(duì)抑制ADA活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少,還不能進(jìn)一步解釋這二種抑制ADA活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與模型組相比,給茶組的體質(zhì)量增加量均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。這可能與紅茶中咖啡堿、兒茶素及其氧化成分等物質(zhì)具有降脂減肥功效有關(guān)。由于高尿酸血癥與其他代謝綜合征的相互關(guān)系,因此推測(cè),這二種茶在降脂減肥的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致尿酸水平的降低。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),紅茶、發(fā)花紅磚茶對(duì)肝臟組織中XOD、ADA活性的抑制水平與其降低血液、尿液中的尿酸水平并未表現(xiàn)出完全一致的對(duì)應(yīng)關(guān)系,可能與尿酸的產(chǎn)生除受XOD、ADA影響外還受其他因素影響所致,或者是這二種茶還參與其他機(jī)制調(diào)控著尿酸水平,但其機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

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