觀賞海棠中McmiR160a的克隆及調(diào)控紅葉著色的功能分析

羅容麗，李雨欣，張 潔，張 杰，姚允聰

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

觀賞海棠常色紅葉品種‘王族’是常見(jiàn)的園林綠化樹(shù)種，色彩艷麗，樹(shù)型優(yōu)美，廣受眾人喜愛(ài)。其葉片的紅色是由于花色素苷的積累導(dǎo)致，花色素苷是植物色澤形成過(guò)程中最重要的組分之一[1]，花色素苷屬酚類化合物中的類黃酮類，是一種水溶性色素，廣泛存在于植物花瓣、果實(shí)的組織中及莖葉的表面細(xì)胞與下表皮層。

miRNAs(microRNAs)長(zhǎng)度約21～23 nt，是一類單鏈小分子RNA。這類小RNA分子由長(zhǎng)度約64～303 nt的前體(pre-miRNA)加工而成，而pre-miRNA則由更長(zhǎng)的pri-RNA加工生成。miRNA是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在很多生物過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。隨著miRNA在不同生物中的大量發(fā)現(xiàn)，對(duì)其功能的研究已引起人們的極大興趣[2]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道有些miRNA與植物體發(fā)育有關(guān)[3]，例如：pri-miR160響應(yīng)SA下調(diào)，但由于赤霉酸，乙烯和茉莉酸甲酯正調(diào)控，從而影響龍眼的胚乳發(fā)育，表明pri-miR160與激素轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[4]。在擬南芥中，miR167及靶基因ARF4和ARF8受藍(lán)光調(diào)控降低蓮座葉數(shù)和葉面積，減少干物質(zhì)生成，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。miR393影響外源2,4-D對(duì)初級(jí)根的生長(zhǎng)，同時(shí)miR393的過(guò)表達(dá)抵消鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制和減輕活性氧(ROS)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[6]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些miRNA能夠參與花色素苷代謝。據(jù)報(bào)道，蘋(píng)果、番茄、葡萄、丹參中miR159，miR319和miR828家族也可以調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子[7]。擬南芥miR156和miR529通過(guò)5′RACE試驗(yàn)驗(yàn)證其與靶基因SPL9和SPL15的剪切方式，通過(guò)抑制靶基因SPL9和SPL15的表達(dá)，參與花色素苷代謝的調(diào)控[8]。在荔枝中，miR156的靶基因?yàn)镾PL家族中的SPL1/2，使用酵母雙雜交和BiFC分析表明LcSPL1蛋白可與LcMYB1蛋白相互作用，而LcMYB1是荔枝花色素苷生物合成中的關(guān)鍵調(diào)控基因[9]，從而證實(shí)miR156-SPLs模塊在荔枝花色素苷生物合成的作用。

miR160a是一個(gè)高度保守的miRNA，在水稻中，miR160a抑制其靶基因ARF18，導(dǎo)致水稻的異常生長(zhǎng)和發(fā)育[10]。miR160a-ARFs受生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)，主要參加激素代謝通道，施加外源生長(zhǎng)素，ARF感知到生長(zhǎng)素后，通過(guò)結(jié)合其調(diào)控區(qū)中的生長(zhǎng)素應(yīng)答元件(AuxRE)來(lái)激活或抑制大量生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的表達(dá)。在擬南芥中，ARF18受外源生長(zhǎng)素的正調(diào)控[11-13]。miR160a-ARFs模板在花色素苷代謝通道上的研究甚少，因此本研究通過(guò)對(duì)觀賞海棠‘王族’中miR160a的前體進(jìn)行克隆，并將其過(guò)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入‘王族’組培苗中，通過(guò)對(duì)花色素苷含量及花色素苷代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，探究觀賞海棠中miR160a對(duì)花色素苷代謝途徑的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)過(guò)程中所用材料為2018年春天采集的北京農(nóng)學(xué)院東大地海棠資源圃自然生長(zhǎng)的觀賞海棠常色紅葉品種‘王族’和北京農(nóng)學(xué)院組培中心的‘王族’組培苗。采后迅速用液氮速凍，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

瞬時(shí)侵染試驗(yàn)采用北京農(nóng)學(xué)院組培中心保存的海棠‘王族’。組培苗培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30%蔗糖+6.5 g/L 瓊脂+0.4 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA；pH 5.8～6.0)。培養(yǎng)條件：溫度23℃±1℃，相對(duì)濕度：70%～75%，光照強(qiáng)度：1 800 Lx，光照時(shí)間：長(zhǎng)日照光照(16 h光/8 h暗)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄 植物材料總RNA提取采用艾德萊EASY spin多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(RN3802)，提取‘王族’葉片中總RNA，采用全式金兩步法RT-PCR試劑盒(AT401-01)。

1.2.2McmiR160a前體的克隆 由于蘋(píng)果和海棠高度同源，使用NCBI找到蘋(píng)果的MdmiR160a的基因信息，可知該序列所在基因組的染色體，是在10號(hào)染色體上的NC_024248.1位置，然后前體序列的上游取200～250 bp，下游取200～250 bp，加上前體序列本身構(gòu)成一段400～500 bp左右的基因序列。通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)正向引物McmiR160a-F：5′-CTTGGATTGAAGGGAGCTC-3′；反向引物McmiR160a-R：5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以‘王族’葉片cDNA為模板，反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL、miR160a-F 1 μL、miR160a-R 1 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、ddH2O 1 μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，目的條帶正確的基因片段用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(博邁德：DH101-1)進(jìn)行膠回收，回收后的目的基因產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt載體上，進(jìn)行涂板、轉(zhuǎn)入大腸桿菌、挑選陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

1.2.3McmiR160a前體過(guò)表達(dá)載體的克隆 將測(cè)序正確的質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1300-eGFP用限制性內(nèi)切酶QuickCutXbaI(TAKARA:1634)和QuickCutkpnI(TAKARA:1618)雙酶切，酶切體系為目的基因/載體10 μL/15 μL、QuickCutTMXbaI 1 μL、QuickCutTMKpnI 1 μL、10×QuickCut buffer 5 μL、ddH2O補(bǔ)充到50 μL，得到DNA小片段和質(zhì)粒大片段，將目的基因、載體與T4DNA連接酶(TAKARA:2011A)輕輕混勻，離心后進(jìn)行金屬浴4℃連接過(guò)夜(16～24 h)，連接體系為：載體DNA 50 ng、插入DNA片段150 ng、T4 DNA連接酶1 μL、T4 DNA連接酶緩沖液2 μL、ddH2O補(bǔ)充到20 μL，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌trans T1，送博邁德公司測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒-20℃保存，并將測(cè)序正確的大腸桿菌加入50%甘油1∶1混勻后液氮速凍之后于-80℃保存。

1.2.4McmiR160a的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌凍融法將2 μL質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入50 μL剛剛?cè)诨霓r(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室留存)中。培養(yǎng)并挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，正確的菌液進(jìn)行大量培養(yǎng)后收集農(nóng)桿菌菌體，加入侵染液(10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2+200 μmol/L AS+無(wú)菌水)調(diào)菌液OD值到0.8～1.0左右。取繼代培養(yǎng)20～25 d左右的生長(zhǎng)良好無(wú)損傷褐化的‘王族’組培苗，采用真空抽吸的方法將菌液轉(zhuǎn)入組培苗中，條件為0.5 Mpa持續(xù)30～40 s后，快速放氣；至0.3 Mpa后，緩慢放氣；至0.2 Mpa后，緩慢放氣。然后用濾紙吸干組培苗表面的液體后，接種于固體培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+頭孢300 mg/L+卡那霉素50 mg/L)上，組培室中培養(yǎng)7～10 d后觀察表型。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)使用說(shuō)明書(shū)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)兩步法(95℃預(yù)變性3 min，94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán))，以18S作為參照基因，所用所有熒光引物見(jiàn)表1，檢測(cè)花色素苷合成途徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和生物合成基因的相對(duì)表達(dá)量。待測(cè)樣品的數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 HPLC法測(cè)定花色素苷含量 將組培苗葉片在液氮下磨成細(xì)粉，稱取1 g粉末加入1 mL花色素苷提取液(體積比是甲醇∶甲酸∶水=80∶1∶19)，之后在45℃的水浴中超聲提取60 min(注意先預(yù)熱到45℃)。將提取的所述花色素苷提取液進(jìn)行純化處理，使用離心機(jī)(12 000 r/min)離心10 min，得到上清液后，使用0.22 μm微孔濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾，并將剩余的濾液在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將過(guò)濾后的上清液裝于液相上樣瓶中用于HPLC檢測(cè)；對(duì)上樣瓶進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)條件：樣品溫度15℃；柱溫40℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量0.4 μL；流動(dòng)相梯度，其中流動(dòng)相A采用0.1%(體積比)甲酸水；流動(dòng)相B采用色譜純乙腈：0 min 10% B，4.5 min 19% B，9.5 min 32% B；10.5 min 35% B；11.5 min 65% B；14 min 95% B；柱子平衡時(shí)間1 min；平衡：14 min 95% B；15 min，10% B。檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm，350 nm；280 nm(甲酸、乙腈均為100%色譜純，用水為18.2 mol/L去離子水)。

1.2.7McmiR160a的靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/)對(duì)McmiR160a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)NCBI比對(duì)，找到該基因的詳細(xì)描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 McmiR160a前體的克隆和過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

以觀賞海棠常色紅葉品種‘王族’葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度為563 bp的McmiR160a前體序列(引物序列見(jiàn)表1)，經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段進(jìn)行膠回收后連接到pEASY-Blunt載體上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI雙酶切，并連接轉(zhuǎn)化，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到McmiR160a過(guò)表達(dá)載體(OE-miR160a)，測(cè)序結(jié)果如圖1所示。

圖1 McmiR160a過(guò)表達(dá)載體序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of expression vector McmiR160a

2.2 McmiR160a的靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站psRNATarget對(duì)McmiR160a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到與McmiR160a高度互補(bǔ)的并且假陽(yáng)性較低的靶基因ARF18，其McmiR160a互補(bǔ)性如圖2所示，可以看出只有在第一個(gè)堿基處有錯(cuò)配。將其比對(duì)到蘋(píng)果基因組中的NCBI上，其在NCBI上的序列號(hào)為L(zhǎng)OC103423002，屬于ARFs家族，具有相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)，即包含一個(gè)保守的B3 DNA結(jié)構(gòu)域，ARF結(jié)構(gòu)域和Aux/IAA結(jié)構(gòu)域。

圖2 McmiR160a與ARF18互補(bǔ)性分析Fig.2 Complementary Analysis of McmiR160a and ARF18

2.3 McmiR160a的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化

將McmiR160a過(guò)表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法瞬時(shí)轉(zhuǎn)入‘王族’組培苗，培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～10 d觀察表型，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)McmiR160a轉(zhuǎn)基因組培苗明顯呈現(xiàn)綠色的表型(圖3)。通過(guò)熒光檢測(cè)后取樣，對(duì)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)McmiR160a植株中花色素苷含量進(jìn)行測(cè)定，過(guò)表達(dá)植株中花色素苷含量明顯低于對(duì)照組。對(duì)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)McmiR160a植株中靶基因ARF18和花色素苷合成途徑中的關(guān)鍵基因CHS、ANS、DFR、MYB10的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，過(guò)表達(dá)McmiR160a后，其靶基因ARF18的表達(dá)量下降，花色素苷合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量都顯著降低。說(shuō)明McmiR160a可以負(fù)調(diào)控觀賞海棠中花色素苷的生物合成(圖4)。

圖3 McmiR160a過(guò)表達(dá)表型圖Fig.3 Phenotypic of OEmiR160a plants

圖4 McmiR160a瞬時(shí)過(guò)表達(dá)植株中花色素苷含量及其結(jié)構(gòu)基因表達(dá)Fig.4 Anthocyanin content and relative expression level of key genes in OEmiR160a plants

3 討 論

近年來(lái)，miRNAs在參與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)激環(huán)境脅迫等方面已有很多的研究進(jìn)展。高蔗糖誘導(dǎo)的miR398以及miR408被高銅消除，這種蔗糖調(diào)節(jié)的銅處理是取決于SPL7的存在[14]。miR156通過(guò)靶基因SPL3調(diào)控PHT1;5或者誘導(dǎo)根際酸化作用參與P缺乏時(shí)的代謝調(diào)控[15]。而花色素苷不僅對(duì)植物組織的呈色，應(yīng)對(duì)外界脅迫至關(guān)重要，同時(shí)還是一種重要的抗氧化物質(zhì)，miRNAs對(duì)花色素苷以及植物生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用。

miR160在蘋(píng)果中高度保守，其在miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的miR160前體有5種：miR160a、miR160b、miR160c、miR160d、miR160e。本研究主要通過(guò)在常色紅葉觀賞海棠‘王族’中進(jìn)行miR160a的前體克隆，得到563 bp的前體序列，并通過(guò)雙酶切的方式構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300-miR160a，瞬時(shí)轉(zhuǎn)入‘王族’組培苗中。使用HPLC法對(duì)轉(zhuǎn)基因組培苗進(jìn)行花色素苷含量測(cè)定，使用qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因組培苗進(jìn)行花色素苷結(jié)構(gòu)基因CHS、ANS、DFR、UFGT及轉(zhuǎn)錄因子MYB10的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)miR160a對(duì)花色素苷有著負(fù)調(diào)控作用。miRNAs主要是通過(guò)對(duì)下游靶基因的剪切抑制來(lái)發(fā)揮作用，miR160a的靶基因ARF18，屬于生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)因子，主要參與激素代謝通路。在番茄中，miR160的主要靶標(biāo)SlARF10a，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素介導(dǎo)的花器官脫落和側(cè)向器官葉片生長(zhǎng)[16]。而花色素苷的調(diào)節(jié)受到各種激素的影響，其中包括生長(zhǎng)素。在擬南芥中，施用3種外源生長(zhǎng)素(IAA，NAA，2,4-D)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子TT8，GL3和PAP1的表達(dá)以及花色素生物合成途徑中的基因如DFR的表達(dá)來(lái)控制花色素苷的生物合成[17]。同時(shí)ARF18受外源生長(zhǎng)素的正調(diào)控，因此ARF18可能對(duì)花色素苷有積極調(diào)控作用。本研究結(jié)果對(duì)miR160a及靶基因ARF18對(duì)花色素苷的具體調(diào)控作用提供一定的理論基礎(chǔ)。