二氫楊梅素對(duì)丙泊酚麻醉引起的大鼠認(rèn)知功能障礙的影響及機(jī)制

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽 421001)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction, POCD)是術(shù)后常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要臨床表現(xiàn)有術(shù)后記憶力減退、注意力不集中和定向能力降低等，其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明清楚[1]。麻醉藥被認(rèn)為是誘發(fā)POCD的主要原因。丙泊酚是常用的靜脈麻醉藥，是通過激活γ氨基丁酸受體-氯離子復(fù)合物而起效。丙泊酚起效較快，誘導(dǎo)期短而平穩(wěn)，蘇醒較快，術(shù)后出現(xiàn)惡心嘔吐等并發(fā)癥的概率較低，常用于麻醉的誘導(dǎo)和維持及危重病人的鎮(zhèn)靜等[2]。然而有研究顯示丙泊酚可改變海馬Tau蛋白磷酸化水平，而導(dǎo)致POCD的發(fā)生[3]，但是其發(fā)病機(jī)制還不清楚。研究表明中樞神經(jīng)炎癥在POCD中發(fā)揮了重要作用，而小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞神經(jīng)炎癥的主要功能細(xì)胞[4-5]。二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DMY)是一種二氫黃酮醇類化合物，又名雙氫楊梅素和福建茶素等，在楊梅科、葡萄科和柳科等植物的莖葉中也均有大量的存在[6]。DMY具有抗炎、抗氧化和鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用[7]。最近有研究表明DMY可通過上調(diào)海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而改善2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙[8]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。但DMY是否能改善丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙，其作用機(jī)制又是否與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有關(guān)，目前還不清楚。因此本研究通過觀察DMY對(duì)丙泊酚麻醉引起的大鼠POCD的影響，并從小膠質(zhì)細(xì)胞極化的角度探討其可能機(jī)制，為POCD的防治提供新的策略和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙泊酚購自西安立邦制藥有限責(zé)任公司，DMY購自成都曼斯特生物科技有限責(zé)任公司。BCA蛋白定量試劑購自美國Invitrogen公司；CD68、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和精氨酸酶1(Arginase1, Arg1)和β-actin抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素-4(interleukin-4, IL-4)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-10(interleukin-10, IL-10)酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)級(jí)Sprague-Dawley(S-D)大鼠，雄性，體質(zhì)量為200 ± 20 g，10周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠飼養(yǎng)在專用動(dòng)物房，室溫為22 ℃，相對(duì)濕度為55%，12 h光照，大鼠能自由攝食和飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

S-D大鼠隨機(jī)地分為對(duì)照組、丙泊酚組、DMY組和丙泊酚組+DMY組，每組12只。丙泊酚組的大鼠通過腹腔注射100 mg/kg丙泊酚一次；DMY組大鼠灌胃給藥DMY(每天200 mg/kg)，共7天；丙泊酚組+DMY組大鼠預(yù)先進(jìn)行腹腔注射100 mg/kg丙泊酚一次，然后灌胃給藥DMY(每天200 mg/kg)，灌胃給藥共7天。DMY用生理鹽水溶解，對(duì)照組大鼠給予腹腔注射和灌胃等量的生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮測(cè)試

灌胃給藥結(jié)束后每組大鼠隨機(jī)地分為兩個(gè)亞組，一個(gè)亞組的大鼠用于Morris水迷宮測(cè)試，另一個(gè)亞組的大鼠用于取材進(jìn)行Western blot分析。灌胃給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在訓(xùn)練的第1天將大鼠放入的水池中，進(jìn)行自由游泳，以熟悉環(huán)境減少應(yīng)激刺激。大鼠熟悉環(huán)境后，將大鼠引導(dǎo)至放置于水池第3象限的平臺(tái)上，停留20 s，將大鼠推入水，待其再找到平臺(tái)，訓(xùn)練共3天。隨后進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每天上午將大鼠面向池壁在標(biāo)記的入水點(diǎn)依次放入水中，然后記錄大鼠120 s內(nèi)爬上平臺(tái)并停留10 s所需要的時(shí)間，即逃避潛伏期，記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)的游泳距離，共進(jìn)行5天?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第二天上午進(jìn)行，將平臺(tái)撤去，大鼠從第三象限進(jìn)水，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和穿越平臺(tái)區(qū)域的時(shí)間。

1.5 ELISA法

尾靜脈采血，1500 g，離心5 min，收集上清液。在酶標(biāo)板的每個(gè)檢測(cè)孔中加待測(cè)樣本和酶結(jié)合物各50 μL，空白對(duì)照孔不加，37℃孵育2 h。吸去液體，每孔加入100 μL顯色劑，混勻，37℃孵育15 min。用空白對(duì)照孔調(diào)零，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清標(biāo)本中TNF-α、IL-1β、IL-6 、IL-4和IL-10的水平。

1.6 Western Blot檢測(cè)

灌胃給藥結(jié)束8天，在尾靜脈采血結(jié)束后，脫頸椎處死大鼠，打開顱骨，取出腦組織，再小心取出海馬。用預(yù)冷的PBS洗滌，按試劑盒說明提取海馬組織總蛋白。采用BAC法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白樣本煮沸變性蛋白，再取蛋白樣品10 μL，SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，4%脫脂牛奶封閉聚偏氟乙烯膜2 h。加入兔抗大鼠CD68、iNOS、Arg1和β-actin的一抗，4℃下孵育過夜。洗膜3次，加入二抗，4℃下孵育4 h。ECL試劑顯影在膠片上，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期的影響

結(jié)果如表1和表2所示：各組大鼠隨著測(cè)試天數(shù)的增加，尋找平臺(tái)的潛伏期均明顯縮短；在定位航行實(shí)驗(yàn)中的第一到第五天，丙泊酚組大鼠與對(duì)照組比較逃避潛伏期和到達(dá)平臺(tái)游過的距離均顯著延長(zhǎng)(均P<0.05)；各組大鼠隨著測(cè)試天數(shù)的增加，到達(dá)平臺(tái)游過的距離均明顯縮短，與丙泊酚組比較，丙泊酚+DMY組大鼠的到達(dá)平臺(tái)游過的距離均顯著減小(均P<0.05)。

表1 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期的影響

表2 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試中到達(dá)平臺(tái)游過的距離的影響

2.2 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試中穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間的影響

結(jié)果如表3所示：空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，丙泊酚組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯減少，穿越平臺(tái)區(qū)域時(shí)間明顯縮短(均P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+DMY組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯增加，穿越平臺(tái)區(qū)域時(shí)間明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)。

表3 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試中穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間的影響

2.3 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

采用Western blot檢測(cè)了大鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD68的表達(dá)，結(jié)果如圖所示：與對(duì)照組比較，丙泊酚組CD68的表達(dá)顯著上調(diào)，與丙泊酚組比較，丙泊酚+DMY組CD68的表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05)。

圖1 DMY和丙泊酚對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

2.4 DMY和丙泊酚大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響

如表 1所示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平顯著增加，而血清中抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的水平顯著降低(均P<0.05)。與丙泊酚組比較，丙泊酚+DMY組血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平顯著降低，而血清中IL-4和IL-10的水平顯著增加(均P<0.05)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志分子iNOS和M2型標(biāo)志分子Arg1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示：與對(duì)照組比較，丙泊酚組海馬組織中iNOS的表達(dá)顯著性上調(diào)，而海馬組織中Arg1顯著性下調(diào)(均P<0.05)。與丙泊酚組比較，丙泊酚+DMY組海馬組織中iNOS的表達(dá)顯著性下調(diào)，而海馬組織中Arg1顯著性上調(diào)(均P<0.05)。

表4 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10水平的影響

圖2 DMY和丙泊酚對(duì)大鼠海馬組織中iNOS(A)和Arg1(B)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

POCD是手術(shù)后常見的并發(fā)癥，其臨床癥狀主要包括記憶力減退、注意力不集中和語言理解能力降低和社會(huì)交往能力減退等，其臨床癥狀常在手術(shù)后幾天到幾周內(nèi)出現(xiàn)，可持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間。POCD機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未闡明清楚明，POCD的發(fā)生可能與血腦屏障的功能紊亂、β淀粉樣蛋白的代謝障礙、膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂、神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞自噬的的異常等有關(guān)[9]。丙泊酚是一種新型的靜脈麻醉藥物，可以抑制海馬CAI區(qū)細(xì)胞突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，導(dǎo)致患者在應(yīng)用丙泊酚麻醉后會(huì)出現(xiàn) POCD。丙泊酚的起效時(shí)間短，蘇醒快，而不良反應(yīng)小是其主要的優(yōu)點(diǎn)。然而近年來的研究表明丙泊酚可通過增強(qiáng)γ氨基丁酸能神經(jīng)元的活性，抑制谷氨酸能神經(jīng)元的活性，從而干擾學(xué)習(xí)記憶相關(guān)神經(jīng)元的功能，抑制認(rèn)知功能，產(chǎn)生順行性和逆行性遺忘等認(rèn)知障礙的表現(xiàn)[10]。本實(shí)驗(yàn)中采用單劑量丙泊酚(100 mg/kg)腹腔注射給藥，通過Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間記憶能力，結(jié)果顯示大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期和到達(dá)平臺(tái)游過的距離均顯著延長(zhǎng)，而大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間明顯減少，這些結(jié)果提示丙泊酚誘導(dǎo)了大鼠的認(rèn)知功能障礙。

黃酮類化合物是一種具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用，近年來的研究表明黃酮類化合物對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能要改善作用[11]。二氫楊梅素(DMY)是一種天然的二氫黃酮類化合物。最早從葡萄科蛇葡萄屬植物楝葉玉葡萄的葉子中分離得到，又名為蛇葡萄素。DMY在葡萄科、楊梅科、藤黃科和柳科等植物中均有分布，而在蛇葡萄幼嫩莖葉中DMY的含量最高[12]。DMY的藥理作用非常廣泛，朱責(zé)梅等研究發(fā)現(xiàn)DMY可通過上調(diào)海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而改善2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙[10]。本研究的結(jié)果顯示DMY(200 mg/kg/d)灌胃給藥顯著抑制了丙泊酚誘導(dǎo)了大鼠的認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期和到達(dá)平臺(tái)游過的距離均顯著減小，而大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和時(shí)間明顯增加。這些結(jié)果表明DMY改善了丙泊酚誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙，但其機(jī)制不清楚。

近年來神經(jīng)炎癥在POCD發(fā)病機(jī)制中作用受到了大量的關(guān)注，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，介導(dǎo)了神經(jīng)炎癥緊。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有經(jīng)典激活(M1型)和替代激活(M2型)兩種形式[13]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12等)可加劇神經(jīng)炎癥性損傷；相反，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)，可抑制神經(jīng)炎癥。小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化和M2型極化的標(biāo)志分子分別iNOS和Arg1[14]。認(rèn)知功能是指大腦對(duì)信息的獲取、儲(chǔ)存、加工和提取的能力，也就是對(duì)事物的構(gòu)成、事物的性能、該事物與他物的關(guān)系、事物的發(fā)展動(dòng)力和方向及基本規(guī)律的把握能力，主要包括學(xué)習(xí)、記憶、語言、執(zhí)行、計(jì)算和判斷等[15]。研究表明與空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能關(guān)系最密切的腦區(qū)是海馬。丙泊酚誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙及DMY改善了丙泊酚誘導(dǎo)大鼠的認(rèn)知功能障礙的機(jī)制是否與小膠質(zhì)細(xì)胞極化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有關(guān)呢？因此我們?yōu)榱藱z測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞極化的標(biāo)志分子的表達(dá)及分泌的特異性細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示丙泊酚著性增加了大鼠海馬組織中iNOS的表達(dá)和血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平，而顯著性降低Arg1的表達(dá)和血清IL-4和IL-10的水平；與丙泊酚比較，丙泊酚+DMY組大鼠海馬組織中iNOS的表達(dá)和血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平顯著降低，而Arg1的表達(dá)和血清IL-4和IL-10的水平顯著增加。這些結(jié)果表明DMY改善了丙泊酚麻醉引起的大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化，促進(jìn)M2型極化實(shí)現(xiàn)的。

總之我們的研究結(jié)果闡明DMY改善了丙泊酚麻醉引起的大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化有關(guān)。我們的研究為POCD的防治提供新的策略和靶點(diǎn)。