蘋果異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子調(diào)控特性研究

杜傳慧 付 艷 王利敏 仇占南 李晨輝 朱元娣

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,北京 100193)

目前,轉(zhuǎn)基因技術(shù)所應(yīng)用的靶基因多為異源基因,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物中不僅含有轉(zhuǎn)入的靶基因,也攜帶抗生素選擇標(biāo)記基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶nptII 基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HYG 基因、抗除草劑als 基因等)、異源報(bào)告基因(β-葡糖苷酸酶GUS 基因、綠色熒光蛋白GFP基因、熒光素酶LUC 基因等)和載體的骨架序列[1]。這種傳統(tǒng)的異源轉(zhuǎn)基因技術(shù)打破了物種間的生殖隔離,改變了原有物種的基因庫(kù),故人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性提出了質(zhì)疑[2]。為了避免轉(zhuǎn)基因作物對(duì)人類及環(huán)境安全造成潛在危害,Nielsen[3]提出了同源轉(zhuǎn)基因的概念,即根據(jù)物種進(jìn)化關(guān)系,目的基因來(lái)源于本物種或雜交親和的近緣物種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。且同源轉(zhuǎn)基因作物不含有外源基因、抗性篩選基因和載體骨架序列[4-5]。此外,同源轉(zhuǎn)基因不改變物種基因庫(kù),消除了外源基因滲入可能產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境和人類健康安全隱患,與常規(guī)雜交育種方法相似,無(wú)不良的連鎖累贅,育種效率高,更容易被消費(fèi)者接受[6-7]。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl transferases, TPT)是細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的第一限速酶,通過(guò)調(diào)控內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平以調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。Smigocki 等[9]將農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒中的ipt 基因,分別連接在CaMV 35S 啟動(dòng)子和ipt 自主啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tobacum L.),進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草的內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量前者是后者的23 倍,分枝數(shù)量前者是后者的6 倍,且過(guò)表達(dá)ipt 基因可以通過(guò)提高內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平加快細(xì)胞完成芽器官發(fā)生的過(guò)程。CaMV 35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ipt 基因轉(zhuǎn)化煙草[10]、水稻(Oryza sativa L.)[11]和白楊(Populus sieboldii×Populus grandidentata)[12]獲得側(cè)芽增多的轉(zhuǎn)基因表型,以這種細(xì)胞分裂素特異的表型作為篩選標(biāo)記,可以直接篩選出轉(zhuǎn)基因株系,避免使用抗生素或除草劑的選擇標(biāo)記。常規(guī)轉(zhuǎn)基因多采用來(lái)源于花椰菜花葉病毒的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子CaMV 35S,但其不能保證轉(zhuǎn)基因植株的安全性[13]。此外,在聚合育種中,多個(gè)基因使用相同的啟動(dòng)子,可能會(huì)導(dǎo)致同源性基因沉默[14],且轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)表達(dá)會(huì)影響植物本身的代謝平衡和正常的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。因此,采用植物啟動(dòng)子或基因自主的啟動(dòng)子替代異源強(qiáng)啟動(dòng)子,可有效地對(duì)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行改良。

MdIPT3a 是蘋果(Malus×domestica Borkh.)MdIPTs家族的一個(gè)功能基因,在蘋果營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官均有表達(dá),過(guò)量表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出典型的細(xì)胞分裂素特異的生長(zhǎng)表型[16-17],即此表型可作為蘋果同源轉(zhuǎn)基因的潛在篩選標(biāo)記。為探究MdIPT3a 基因的有效啟動(dòng)子長(zhǎng)度,本研究克隆了不同長(zhǎng)度的MdIPT3a 基因上游調(diào)控序列片段,構(gòu)建MdIPT3a 自主啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS 基因的植物表達(dá)載體,遺傳轉(zhuǎn)化煙草Wisconsin 38,通過(guò)組織染色及半定量PCR 方法,定量和定性分析GUS 基因的表達(dá),研究MdIPT3a 啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的影響,以期明確MdIPT3a 啟動(dòng)子的功能,為實(shí)現(xiàn)MdIPT3a 的蘋果同源轉(zhuǎn)基因提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 采集富士蘋果10年生樹葉片。煙草Wisconsin 38 組培苗為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹系朱元娣老師課題組保存,繼代培養(yǎng)基為添加3%蔗糖和0.65%瓊脂的MS 培養(yǎng)基。

1.1.2 載體、菌株及主要試劑 載體pMD19-T Simple、載體pMD18-T 以及大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物(大連) 工程有限公司； 載體pCAMBIA1391、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院朱元娣保存。DNA 片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司；premix Taq version 2.0、premix Taq LA Taq version、T4 DNA 連接酶和PrimeScriptTMStrand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自TaKaRa(日本)公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEW ENGLAND Biolabs(北京),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成和DNA 測(cè)序均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 富士蘋果基因組DNA 的提取 采用CTAB法[18]提取富士蘋果葉片DNA。

1.2.2 MdIPT3a 基因啟動(dòng)子的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https：/ /www.rosaceae.org/)中分析MdIPT3a(GenBank 登錄號(hào)：LOC103432442)的上游序列,據(jù)此設(shè)計(jì)引物MdIPT3a P1-F/R(GGCACTA AATGTAAATAAAGGTGT/GGACTAGTCATGCTGGTGA TGATCAAATACTTTATCTG,ACTAGT為SpeⅠ酶切位點(diǎn),下同),PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為2 739 bp。以富士蘋果基因組DNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸3 min,35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收純化目的條帶,連接pMD18-T 載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后測(cè)序。

利用啟動(dòng)子核心區(qū)域分析網(wǎng)站BDGP(Berkeley Drosophila Genome Project,http：/ /www.bdgp.org/)、啟動(dòng)子元件分析網(wǎng)站PlantCARE(http：/ /bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/plantcare/html/)對(duì)MdIPT3a 基因上游調(diào)控序列進(jìn)行核心元件分析[16]。

依據(jù) MdIPT3a 基因啟動(dòng)子序列和載體pCAMBIA1391 上的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增長(zhǎng)度不同的上游調(diào)控序列。啟動(dòng)子P1 代表MdIPT3a 基因的上游2 739 bp 的序列片段；P2 代表基因上游1 512 bp 的序列片段,特異引物MdIPT3aP2-F/R(CCCAAGCTTCTCACTATCCTGCAATCTGT/GGACTAGT CATGCTG GTGATGATCAAATACTTTATCTG,AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn),下同)；P3 代表基因上游949 bp 的序列片段,MdIPT3aP3-F(CCCAAGCTTAAATCCACTGTATGC GAAG/GGACTAGTCATGCTGGTGATGATCAAATACTT TAT C TG)；P4 代表基因上游446 bp 的序列片段,MdIPT3aP4-F/R(CCCAAGCTTATTTCCTTTTTTTTCTA CCTCCACAG/GGACTAGTCATGCTGGTGATGATCAAA TACTTTATCTG)。

以富士蘋果基因組DNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,程序同上。取測(cè)序正確的陽(yáng)性菌菌液200 μL,提取質(zhì)粒。將載體pCAMBIA1391 和啟動(dòng)子回收質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,分別將各啟動(dòng)子片段與pCAMBIA1391 載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng),并回收純化,再將各啟動(dòng)子片段與pCAMBIA1391 載體用T4 連接酶16℃條件下過(guò)夜連接。

1.2.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 在超凈工作臺(tái)中,將重組質(zhì)粒10 μL(約1 μg)與100 μL 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上輕輕混勻,靜置30 min,立即放入液氮中冷凍1 min,隨即轉(zhuǎn)入37℃水浴5 min,在上述盛有菌液的離心管中加入1 mL YEP 液體培養(yǎng)基(不含抗生素)于28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)4 ～5 h 后,吸取菌液100 μL 涂布于YEP 平板[添加50 mg·L-1卡那霉素(Kana)和75 mg·L-1利福平(Rif)],28℃培養(yǎng)40 h,采用PCR 鑒定陽(yáng)性菌株。

將陽(yáng)性菌株按體積比1 ∶100 接種于添加50 mg·L-1Kana 和50 mg·L-1Rif 的YEP 液體培養(yǎng)基中,28℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至菌體的OD600值介于0.6～0.8。將菌體裝入無(wú)菌的50 mL 離心管中,5 000 r·min-1離心10 min,棄上清后用1/2 體積的MS 懸浮液(pH 值7.0,添加100 μmol·L-1的乙酰丁香酮)重新懸浮菌體。采用葉盤法[19]侵染煙草,黑暗條件下共培養(yǎng)3 d,然后轉(zhuǎn)入煙草葉片再生培養(yǎng)基[MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8.2 g·L-1+潮霉素(Hyg)10 mg·L-1+頭孢霉素(Cef)400 mg·L-1,pH 值5.8],每?jī)芍芾^代培養(yǎng)1 次。不定芽再生后,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基[MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉8.2 g·L-1+ Cef 500 mg·L-1,pH 值5.8],每月繼代培養(yǎng)1次。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的GUS 組織學(xué)染色分析 選取生根培養(yǎng)20 d 后,生長(zhǎng)狀態(tài)一致的各轉(zhuǎn)基因系的煙草組培苗各3 株,采集不定芽、幼葉、展開葉、幼莖和根進(jìn)行GUS 組織染色[20]。以X-gluc 為反應(yīng)底物配制GUS 染色液,將待檢樣品浸泡于分裝好的GUS 染色液中,37℃黑暗條件下孵育1 ～2 d。將染色后的樣品取出,用70%乙醇37℃脫色,用適量去離子水清洗后在RHST60-2L 解剖鏡(福建睿鴻光電科技有限公司)下觀察染色情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的GUS 基因表達(dá)檢測(cè) 以生根培養(yǎng)20 d 的轉(zhuǎn)基因煙草組培苗為試驗(yàn)材料,分別采集地上部(含芽、葉、莖)和地下部(根),利用改良的CTAB法[21]提取RNA,并用NanoDrop2000/2000c 微量紫外分光光度計(jì)(賽默飛,美國(guó))檢測(cè)RNA 純度和濃度。取1 μg RNA 用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照寶生生物(大連)有限公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 的操作說(shuō)明書進(jìn)行。以煙草肌動(dòng)蛋白Actin 基因(G-eneBank 登陸號(hào)：U60495)為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)引物Actin-F/R(AAGGGATGCGAGGATGG A/CAAGGAAATCACCGCTTTGG),PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為105 bp。根據(jù)載體中GUS 基因序列信息,設(shè)計(jì)引物GUSF/R(GGGCAACAAGCCGAAAGA/GTGTGAGCGTCGC AGAACATTA),PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為258 bp。

以轉(zhuǎn)基因煙草樣本的cDNA 為模板,以煙草Actin為內(nèi)參基因,通過(guò)Actin 調(diào)整各樣本cDNA 模板用量,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的地上部(芽、葉、莖)和地下部(根)進(jìn)行半定量RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為Ex Taq 酶5 μL,正反引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。RT-PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以Actin 為內(nèi)參基因,用Lane 1D 凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量灰度分析,以灰度比值(目的條帶光密度值/Actin 條帶光密度值)代表GUS 基因的表達(dá)強(qiáng)度；用SPSS Statistics 軟件對(duì)GUS基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析,分別比較轉(zhuǎn)基因煙草地上部和地下部的GUS 表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 富士蘋果MdIPT3a 基因啟動(dòng)子序列分析

將克隆的MdIPT3a 基因上游序列在BDGP 網(wǎng)站預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),并在PLANTCARE 網(wǎng)站(http：/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上進(jìn)行啟動(dòng)子元件的分析。MdIPT3a 基因的啟動(dòng)子中含有特征元件TATA-box 和CAAT-box,未發(fā)現(xiàn)GCbox。啟動(dòng)子中含有多個(gè)光響應(yīng)元件(Box4、Sp1、MRE、GT1-motif 和Ⅰ-box,其中MRE 是MYB 的結(jié)合位點(diǎn))、晝夜節(jié)律調(diào)控元件Circadian、參與防御及脅迫應(yīng)答的元件TC-rich repeats、真菌響應(yīng)元件Box-W1、低溫響應(yīng)元件LTR、熱激響應(yīng)元件HSE、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGAelement、乙烯響應(yīng)元件ERE、水楊酸響應(yīng)元件TCAelement、胚乳表達(dá)所需的元件Skn-1-motif 以及芽特異表達(dá)元件as-2-box 等(圖1、表1)。

在BDGP 網(wǎng)站預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),得到3 個(gè)可能性較大的預(yù)測(cè)結(jié)果,分別位于翻譯起始密碼子ATG上游的-508、-322 和-205 bp 處。PLANTCARE 網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果位于翻譯起始密碼子上游-508 bp(序列為CAAATCA)和-322 bp(序列為TACACGA,A 為預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)),推測(cè)富士蘋果MdIPT3a 基因可能從翻譯起始密碼子上游-322 bp 處起始轉(zhuǎn)錄(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS 染色檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因煙草GUS 染色結(jié)果顯示,同一轉(zhuǎn)基因系的不同株系之間的GUS 染色結(jié)果差異不明顯；不同轉(zhuǎn)基因系之間的GUS 染色結(jié)果差異明顯,不同長(zhǎng)度MdIPT3a 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 基因均能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá),但較對(duì)照CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 基因表達(dá)弱,CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 在不定芽、幼葉、展開葉、幼莖和根中表達(dá)最強(qiáng)。MdIPT3aP1 和MdIPT3aP2 的轉(zhuǎn)基因煙草中所檢測(cè)的器官組織均有表達(dá),幼葉GUS 染色明顯,其他器官中染色較淺；MdIPT3a P3 轉(zhuǎn)基因煙草的不定芽、幼葉、展開葉和根中染色都較明顯；MdIPT3a P4 染色結(jié)果中不定芽和幼葉染色明顯,其他器官較淺。比較不同長(zhǎng)度的MdIPT3a 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 表達(dá)可知,MdIPT3aP3 轉(zhuǎn)基因煙草中GUS 染色明顯,GUS 表達(dá)水平高(圖2)。

表1 蘋果MdIPT3a 基因的啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 1 The analysis of cis-acting elements of apple MdIPT3a promoter

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS 基因表達(dá)分析

構(gòu)建長(zhǎng)度分別為2 739、1 512、949、446 bp 的MdIPT3a 自主啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS 的表達(dá)載體(圖3-A)。半定量RT-PCR 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因煙草的地上部和地下部中均檢測(cè)到GUS 基因表達(dá),MdIPT3a 的4 個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子均可以驅(qū)動(dòng)GUS 基因表達(dá),CK 中CaMV 35S 驅(qū)動(dòng)的GUS 表達(dá)量,在地上部和地下部均顯著高于MdIPT3a 的4 個(gè)自主啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因煙草中MdIPT3a P3 驅(qū)動(dòng)的GUS 基因表達(dá)量顯著高于MdIPT3a P1、MdIPT3a P2 和MdIPT3a P4,且這3 個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 表達(dá)量無(wú)顯著差異,地上部和地下部的GUS 表達(dá)結(jié)果一致(圖3-B)。

3 討論

植物啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用,核心啟動(dòng)子大約在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-40 ～+50 bp 之間,具有結(jié)合并控制轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物的裝配、定位轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并控制轉(zhuǎn)錄的方向、對(duì)細(xì)胞內(nèi)臨近或遠(yuǎn)處的激活子或抑制子做出響應(yīng)等功能[22-23]。研究表明,植物基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)具有共同的結(jié)構(gòu)模式,腺嘌呤A 為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn),標(biāo)記為0,兩側(cè)多為嘧啶堿基,在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-25～-30 bp 處有TATA 序列,-70 ～-78 bp 處有CAAT,-80～-110 bp 區(qū)含有GC 盒,TATA 和上游的保守序列共同作用確保精確而有效地起始轉(zhuǎn)錄[24-25]。本研究預(yù)測(cè)MdIPT3a 啟動(dòng)子有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),分別是起始密碼子 ATG 上游- 508 bp (序列為CAAATCA)和-322 bp(序列為TACACGA)。TATAbox 在起始密碼子上游-347～-354 bp,CAAT-box 在起始密碼子上游-391 ～-395 bp,分別與預(yù)測(cè)的第一個(gè)-322 bp的轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)相距25 bp 和69 bp,與前人對(duì)植物基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)模式的研究結(jié)果一致。第2 個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(起始密碼子上游-508 bp)與其上游的TATA-box(起始密碼子上游-528 ～-535 bp)和CAAT-box(起始密碼子上游-602 ～-605 bp)分別相距20 bp 和94 bp,轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)兩側(cè)多為腺嘌呤,非嘧啶堿基,與植物基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)模式不符,推測(cè)MdIPT3a 從起始密碼子上游-322 bp 處起始轉(zhuǎn)錄。GUS 染色和半定量RT-PCR 分析結(jié)果表明,長(zhǎng)度為446 bp 的MdIPT3a 啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS 基因表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了MdIPT3a 可能從起始密碼子上游-322 bp處起始轉(zhuǎn)錄。

圖1 富士蘋果MdIPT3a 基因上游序列順式作用元件分析Fig.1 Analysis of cis acting elements in the upstream sequence of MdIPT3a gene from apple cultivar Fuji

啟動(dòng)子通過(guò)順式作用元件來(lái)調(diào)控基因的表達(dá),因此啟動(dòng)子的長(zhǎng)度可以影響基因的表達(dá)水平,這與不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子所包含的順式作用元件的多少和類型有關(guān)[26-27]。如蘋果黑星病抗性基因HcrVf2 的不同啟動(dòng)子長(zhǎng)度影響轉(zhuǎn)基因蘋果的抗性水平,短啟動(dòng)子(115 bp)驅(qū)動(dòng)效率最低,288 bp 的驅(qū)動(dòng)效率最高,長(zhǎng)啟動(dòng)子(779 bp)介于二者之間[27-28]。此外,對(duì)序列分析發(fā)現(xiàn),115 bp 啟動(dòng)子只包含一個(gè)TATA-box 和預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),而288 bp 的啟動(dòng)子還包含1 個(gè)CAATbox、2 個(gè)DOF 元件(與Dof 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合)、光調(diào)控元件(1 個(gè)GATA 元件、3 個(gè)GT-1 元件、2 個(gè)Ⅰbox),779 bp 啟動(dòng)子包含的順式元件的數(shù)量和種類較288 bp 更多[28]。本研究中,不同長(zhǎng)度的MdIPT3a 啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)GUS 基因在轉(zhuǎn)基因植株地上部和地下部中表達(dá),且以MdIPT3aP3 驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的能力最強(qiáng),說(shuō)明啟動(dòng)子的長(zhǎng)度影響了基因的表達(dá)水平。MdIPT3a 基因上游序列存在多個(gè)順式作用元件,在生物及非生物脅迫影響下調(diào)控基因的表達(dá),且很多響應(yīng)元件以多拷貝形式存在, 可能具有增強(qiáng)防御響應(yīng)調(diào)控作用[29-30]。MdIPT3aP1 作為最長(zhǎng)的自主啟動(dòng)子,GUS 染色較淺和GUS 表達(dá)量較低,可能與順式作用元件多且調(diào)控基因表達(dá)的因素較多相關(guān)。MdIPT3aP4 是最小的啟動(dòng)子,含預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA-box 和CAAT-box,具有啟動(dòng) 子 的 核 心 結(jié) 構(gòu), 能 夠 驅(qū) 動(dòng) GUS 表 達(dá)。與MdIPT3aP4 相比,啟動(dòng)子MdIPT3aP3 還包含1 個(gè)真菌響應(yīng)元件Box-W1、2 個(gè)晝夜節(jié)律調(diào)控元件Circadian、2個(gè)脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、1 個(gè)胚乳表達(dá)必需元件Skn-1-motif 和1 個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)BoxⅢ,在本研究所設(shè)計(jì)的4 個(gè)啟動(dòng)子中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)效率最高,與前人關(guān)于黑星病抗性基因HcrVf2 啟動(dòng)子的研究結(jié)果一致[27-28]。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株不同組織中GUS 表達(dá)分析Fig.2 The analysis of GUS expression in different tissues of transgenic tobaccos

由于IPT 基因作為標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入植物體會(huì)打破植株的頂端優(yōu)勢(shì),使側(cè)芽萌發(fā)過(guò)量,造成生長(zhǎng)發(fā)育畸形[10],因此同源轉(zhuǎn)基因中除了要使用基因自主啟動(dòng)子外,還要將標(biāo)記基因刪除。通過(guò)GST-MAT 載體系統(tǒng)中R 重組酶[31-32]或化學(xué)調(diào)控DNA 特異位點(diǎn)的切除系統(tǒng)[33],可獲得無(wú)外源基因的轉(zhuǎn)基因植株[34]。若將本研究中MdIPT3a 基因自主啟動(dòng)子與無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因或同源轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,可進(jìn)一步優(yōu)化蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化,提高育種效率。

4 結(jié)論

圖3 不同長(zhǎng)度MdIPT3a 啟動(dòng)子和GUS 融合基因的構(gòu)建(A)及轉(zhuǎn)基因植株的GUS 表達(dá)(B)Fig.3 Constructs of MdIPT3a promoters and GUS fusion genes with different lengths (A)and GUS expression in transgenic plants(B)

本研究推測(cè)MdIPT3a 可能從起始密碼子上游-322 bp 處起始轉(zhuǎn)錄,4 個(gè)不同長(zhǎng)度的MdIPT3a 基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS 基因表達(dá)量顯著低于CaMV35S 啟動(dòng)子,MdIPT3a P3 驅(qū)動(dòng)效率高于其他3 個(gè)MdIPT3a 啟動(dòng)子。4 個(gè)MdIPT3a 啟動(dòng)子中,最短的有效啟動(dòng)子長(zhǎng)度為446 bp,包含預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA-box、CAAT-box、ELI-box3 和Box-W1,但MdIPT3a 基因的最短有效啟動(dòng)子長(zhǎng)度尚需設(shè)計(jì)更短的啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果為蘋果的同源轉(zhuǎn)基因的發(fā)展奠定了一定的理論基礎(chǔ)。