納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活效果及其細(xì)胞毒性?

刁 菁， 李 樂(lè)， 王曉璐， 許 拉， 于曉清， 蓋春蕾， 樊 英， 葉海斌?? ， 劉洪軍， 王勇強(qiáng)

(1. 山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104； 2.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104； 3.日照市萬(wàn)澤豐漁業(yè)有限公司，山東 日照 250000)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)是導(dǎo)致冷水魚(yú)癤瘡病及皮膚潰瘍病的病原菌，其宿主范圍廣，包含至少5個(gè)亞型，是冷水魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中危害較重的一種常見(jiàn)致病菌[1-3]，對(duì)于該菌的防治技術(shù)研究一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注焦點(diǎn)。目前，魚(yú)用疫苗是公認(rèn)最安全有效的防病途徑，特別是針對(duì)大型深海網(wǎng)箱及養(yǎng)殖工船等裝備型養(yǎng)殖模式，如果在入海前對(duì)魚(yú)體實(shí)施疫苗免疫，能夠提高魚(yú)體對(duì)特定病原的抗病力，從而降低深海養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病發(fā)生率。在水產(chǎn)疫苗工業(yè)中最為常用的形式是滅活疫苗, 例如弧菌、氣單胞菌和草魚(yú)呼腸孤病毒等滅活疫苗的免疫保護(hù)性非常明顯[4-6]。滅活是滅活疫苗生產(chǎn)中最關(guān)鍵、最基本的技術(shù)之一, 抗原滅活效果的好壞與滅活劑息息相關(guān), 理想的滅活應(yīng)是滅活病原徹底并保持抗原的免疫原性,免疫疫苗后機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù), 同時(shí)無(wú)論對(duì)魚(yú)類(lèi)還是人類(lèi), 均不產(chǎn)生安全問(wèn)題?；瘜W(xué)滅活劑甲醛是最傳統(tǒng)且應(yīng)用最廣泛的滅活劑，但是存在刺激性、致癌危險(xiǎn)、破壞免疫原性、滅活不徹底、滅活時(shí)間長(zhǎng)、滅活效果受多種因素影響等缺陷[7], 因此篩選較甲醛更優(yōu)良的滅活劑已成為當(dāng)前滅活疫苗研制中需要解決的迫切課題, 對(duì)于生產(chǎn)高效、安全的滅活疫苗具有十分重要的意義。

鋅是一種動(dòng)物必需的微量元素，多項(xiàng)研究表明鋅能夠影響動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫、成骨以及代謝功能[8-9]。同時(shí)，鋅還具有良好的抗菌作用，特別是利用納米技術(shù)研制的納米鋅抗菌劑，它具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)及量子尺寸效應(yīng)等一系列納米材料特有性質(zhì)，能大大提升傳統(tǒng)鋅材料的抗菌性能，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌和病毒等均顯示出顯著的殺滅作用[10-11]，并且納米鋅作為一種新型鋅源，具有良好的生物相容性，同時(shí)還具有較高的生物活性、良好的免疫調(diào)節(jié)能力和高吸收率。由于其性狀穩(wěn)定、資源豐富且對(duì)環(huán)境無(wú)毒害作用，目前已推廣應(yīng)用于醫(yī)藥、畜牧、公共衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域。

鑒于以上納米鋅優(yōu)良的特性，為了探究納米鋅用于制備水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌滅活疫苗的可行性，本研究測(cè)定了納米鋅溶液在不同條件下對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活作用，檢測(cè)了納米鋅滅活對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體蛋白和免疫原性影響，制備出殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗并與甲醛滅活疫苗的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了比較，另外研究了納米鋅溶液對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響。研究結(jié)果為魚(yú)用滅活疫苗的研制及應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殺鮭氣單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏的菌株；鯉上皮瘤 (Epithelioma papulosum cyprini，EPC) 細(xì)胞由山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈(zèng)；健康硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)由日照萬(wàn)澤豐漁業(yè)有限公司提供，平均體重為(105±5) g，平均體長(zhǎng)為(20±2) cm。

納米鋅水溶液原液(濃度為50 g/L)由南京精德豐新材料科技有限公司研制，其中納米鋅粒徑為30～80 nm；M199培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品；阿爾瑪藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Mueller-Hinton(MH)肉湯和瓊脂購(gòu)自青島海博生物有限公司；上樣緩沖液購(gòu)自索萊寶公司；AP標(biāo)記羊抗鼠Ig購(gòu)自Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2 不同條件下納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活效果

待滅活細(xì)菌的準(zhǔn)備：將MH肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)的殺鮭氣單胞菌室溫6 000 r/min離心10 min，細(xì)菌沉淀用生理鹽水(0.9% NaCl溶液)重懸，再離心收集沉淀，重復(fù)2次，最后用生理鹽水重懸并調(diào)整細(xì)菌濃度至1.5×109個(gè)/mL，分裝于50 mL離心管內(nèi)，每管30 mL。

納米鋅滅活實(shí)驗(yàn)：共設(shè)置4個(gè)納米鋅滅活濃度，即用生理鹽水將納米鋅原液進(jìn)行稀釋并分別加入上述離心管內(nèi)充分混勻，最終管內(nèi)納米鋅終濃度分別為50、100、200和400 mg/L，對(duì)照管加入等體積生理鹽水。然后將每個(gè)滅活管內(nèi)菌液分為3等份，分別放置于4、28及37 ℃條件下進(jìn)行滅活。每隔12h，從各滅活管內(nèi)取1mL菌液，離心收集沉淀并用生理鹽水洗滌2次去除納米鋅，然后取重懸后的菌液涂布MH瓊脂培養(yǎng)板，每個(gè)處理涂布3個(gè)平板，每板涂布100 μL。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后觀(guān)察并記錄細(xì)菌生長(zhǎng)情況。剩余菌液用于菌體蛋白及免疫原性的檢測(cè)。

1.3 納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性的影響

1.3.1 SDS-PAGE檢測(cè)納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體蛋白組成的影響 根據(jù)1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在收集的不同濃度及不同溫度條件下，最短滅活時(shí)間的納米鋅滅活菌液及未滅活的對(duì)照菌液中，按體積比1∶4加入4×上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min，冷卻后點(diǎn)樣進(jìn)行SDS-PAGE；電泳凝膠由濃度為12%分離膠和濃度為5%濃縮膠兩部分組成；采用Tris-Gly電泳緩沖液(0.025 mol/L Tris，0.25 mol/L Gly，0.1% SDS，pH=8.3)，4 ℃穩(wěn)流條件下電泳，濃縮膠30 mA，分離膠60 mA，至溴酚藍(lán)指示劑遷移至分離膠底部邊緣時(shí)停止電泳；將凝膠放入固定液中固定1h，然后用考馬斯亮藍(lán)(CBB-R250)染色4h，放入7%乙酸脫色液中脫色，拍照。

1.3.2 掃描電鏡檢測(cè)納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體結(jié)構(gòu)的影響 在6 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，分別收集50和400 mg/L濃度納米鋅在不同溫度下滅活的菌體，用2.5%戊二醛前固定, 1%鋨酸后固定, 磷酸緩沖液沖洗, 梯度乙醇脫水, 臨界點(diǎn)干燥后噴金, 經(jīng)AMRAY-1830 型掃描電鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.3 間接ELISA檢測(cè)納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌免疫原性的影響 離心收集培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的殺鮭氣單胞菌，將菌體密度調(diào)整至5×107CFU/mL，參考張銘偉等[12]方法以全菌免疫小鼠制備鼠抗殺鮭氣單胞菌多克隆血清抗體。同時(shí)，在4 ℃條件下離心收集4種濃度納米鋅在不同溫度下最短時(shí)間滅活的菌體及未滅活的對(duì)照菌體，并用生理鹽水調(diào)整濃度至OD600為0.1±0.01，然后加入酶標(biāo)板中4 ℃包被過(guò)夜；次日加入3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，37 ℃下封閉45 min；去除封閉液，用PBST洗3次，每次5 min；加入鼠抗殺鮭氣單胞菌血清(1∶200)，37 ℃ 孵育1 h(間或輕輕震蕩)，陰性對(duì)照為免疫前小鼠血清； PBST洗3次后，加入AP標(biāo)記羊抗鼠Ig，37 ℃下孵育1 h；PBST洗3次后，將pNPP發(fā)色液加入酶標(biāo)板發(fā)色30 min，2 mol/L NaOH終止發(fā)色，酶標(biāo)儀405 nm測(cè)OD值。

1.4 殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗的免疫保護(hù)力測(cè)定

根據(jù)1.3結(jié)果，選擇對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性影響最小的納米鋅滅活參數(shù)，制備出納米鋅滅活疫苗；同時(shí)利用0.1%的甲醛溶液在28 ℃條件下對(duì)殺鮭氣單胞菌滅活5 h，經(jīng)平板涂布培養(yǎng)法驗(yàn)證已徹底滅活，制備出甲醛滅活疫苗；然后將2種滅活疫苗濃度調(diào)整至OD600為0.1±0.01，利用腹腔注射的方法分別免疫健康虹鱒，每尾100 μL，對(duì)照組注射同體積的無(wú)菌生理鹽水，每組免疫30尾，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，養(yǎng)殖水溫為(17±1) ℃，全天充氣，每天換水50%；免疫后40 d用殺鮭氣單胞菌進(jìn)行攻毒，每尾腹腔注射濃度為5.0×107CFU/mL的菌液100 μL；每天定時(shí)觀(guān)察并記錄各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)體死亡數(shù)量，計(jì)算2種滅活疫苗對(duì)殺鮭氣單胞菌感染的相對(duì)免疫保護(hù)率。

1.5 納米鋅對(duì)鯉上皮瘤(EPC)細(xì)胞毒性的研究

將納米鋅溶液用M199培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)2倍梯度稀釋至濃度為100、200、400、800、1 600和3 200 mg/L，然后分別與密度為2.5×106個(gè)/mL的EPC細(xì)胞懸液1∶1混合均勻，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于20 ℃培養(yǎng)，12 h后觀(guān)察細(xì)胞貼壁情況，3 d后觀(guān)察細(xì)胞存活情況,6 d后在每個(gè)孔內(nèi)加入10 μL阿爾瑪藍(lán)指示劑，置于20 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定波長(zhǎng)下和605 nm參考波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞活性值。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度條件下納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活效果

在3個(gè)不同溫度條件下分別加入不同濃度的納米鋅，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間孵育處理殺鮭氣單胞菌后，菌體存活情況經(jīng)測(cè)定顯示，加入的納米鋅濃度越高，其對(duì)殺鮭氣單胞菌完全滅活的時(shí)間越短，同時(shí)隨著作用溫度的升高，納米鋅對(duì)菌體完全滅活的時(shí)間縮短(見(jiàn)表1)。400、200、100 和50 mg/L濃度的納米鋅分別在72、96、108和120 h之內(nèi)可以將殺鮭氣單胞菌完全滅活；同樣濃度納米鋅在不同溫度下對(duì)細(xì)菌的滅活時(shí)間不同，其中在37 ℃條件下納米鋅滅活時(shí)間最短，4種濃度納米鋅均可在60 h內(nèi)將細(xì)菌完全滅活，400 mg/L納米鋅在24 h內(nèi)即可將細(xì)菌完全滅活；其次為28 ℃條件下，4種濃度納米鋅均可在96 h內(nèi)將細(xì)菌完全滅活；滅活作用最慢的為4 ℃條件下，完全滅活時(shí)間最短為72 h，最長(zhǎng)達(dá)到120 h。

表1 不同濃度納米鋅在不同溫度下孵育處理殺鮭氣單胞菌不同時(shí)間后菌體的存活情況

注：+表示細(xì)菌存活，-表示細(xì)菌死亡。Note: + means alive bacteria, - means inactivated bacteria.

2.2 納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體蛋白及免疫原性的影響

2.2.1 SDS-PAGE檢測(cè)納米鋅對(duì)菌體蛋白的影響 將收集的不同濃度及不同溫度條件下，最短滅活時(shí)間的納米鋅滅活菌體收集進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀(guān)察滅活菌體蛋白組成及濃度變化，如圖1所示，不同條件下納米鋅滅活的殺鮭氣單胞菌菌體蛋白組成及濃度與未經(jīng)納米鋅滅活的殺鮭氣單胞菌相同，沒(méi)有出現(xiàn)蛋白條帶丟失或蛋白濃度明顯降低的現(xiàn)象。

2.2.2 掃描電鏡觀(guān)察納米鋅對(duì)菌體形態(tài)的影響 利用掃描電鏡分別觀(guān)察了50和400 mg/L濃度納米鋅在不同溫度下滅活的菌體形態(tài)，如圖2所示，在4和28 ℃滅活條件下，2種濃度納米鋅對(duì)菌體完整性的破壞程度相差不大，滅活后的菌體大部分保持了原有的完整結(jié)構(gòu)，僅出現(xiàn)少量細(xì)菌碎片，但37 ℃滅活條件下，滅活后的菌體結(jié)構(gòu)破壞較明顯，視野中出現(xiàn)較多的菌體碎片。

(M. 蛋白Marker；1.正常細(xì)菌對(duì)照; 2. 400 mg/L-4 ℃-72 h滅活菌體; 3. 400 mg/L-28 ℃-60 h滅活菌體; 4. 400 mg/L-37 ℃-24 h滅活菌體; 5. 200 mg/L-4 ℃-96 h滅活菌體; 6. 200 mg/L-28 ℃-72 h滅活菌體; 7. 200 mg/L-37 ℃-36 h滅活菌體; 8. 100 mg/L-4 ℃-108 h滅活菌體; 9. 100 mg/L-28 ℃-84 h滅活菌體; 10. 100 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體; 11. 50 mg/L-4 ℃-120 h滅活菌體; 12. 50 mg/L-28 ℃-96 h滅活菌體; 13 50 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體。M. Marker; 1. normal bacteria as control; 2. 400 mg/L-4 ℃-72 h inactivated bacteria; 3. 400 mg/L-28 ℃-60 h inactivated bacteria; 4. 400 mg/L-37 ℃-24 h inactivated bacteria; 5. 200 mg/L-4 ℃-96 h inactivated bacteria; 6 200 mg/L-28 ℃-72 h inactivated bacteria; 7. 200 mg/L-37 ℃-36 h inactivated bacteria; 8 100 mg/L-4 ℃-108 h inactivated bacteria; 9. 100 mg/L-28 ℃-84 h inactivated bacteria; 10. 100 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria; 11. 50 mg/L-4 ℃-120 h inactivated bacteria; 12. 50 mg/L-28 ℃-96 h inactivated bacteria; 13. 50 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria.)

圖1 不同濃度納米鋅在不同溫度條件下最短時(shí)間滅活菌體的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.1 The SDS-PAGE of inactivated bacteria with shortest time under different concentrations of nanometer zinc and temperature

(A1. 50 mg/L-4 ℃-120 h滅活菌體; A2. 50 mg/L-28 ℃-96 h滅活菌體; A3. 50 mg/L-37 ℃-60 h滅活菌體; B1. 400 mg/L-4 ℃-72 h滅活菌體; B2. 400 mg/L-28 ℃-60 h滅活菌體; B3. 400 mg/L-37 ℃-24 h滅活菌體。A1. 50 mg/L-4 ℃-120 h inactivated bacteria; A2. 50 mg/L-28 ℃-96 h inactivated bacteria; A3. 50 mg/L-37 ℃-60 h inactivated bacteria; B1 400 mg/L-4 ℃-72 h inactivated bacteria; B2 400 mg/L-28 ℃-60 h inactivated bacteria; B3 400 mg/L-37 ℃-24 h inactivated bacteria.)

圖2 掃描電鏡檢測(cè)不同濃度納米鋅在不同溫度條件下滅活菌體的形態(tài)

Fig.2 Scanning electron microscopic image of inactivated bacteria under different concentrations of nanometer zinc and temperature

2.2.3 ELISA檢測(cè)納米鋅對(duì)菌體抗原性的影響 利用制備的抗血清結(jié)合ELISA技術(shù)檢測(cè)不同滅活條件下殺鮭氣單胞菌抗原性結(jié)果顯示，與包被未滅活菌體的對(duì)照組相比，4 ℃條件下各納米鋅濃度滅活組菌體抗原性均未受到顯著性影響，然而在28 ℃條件下，200和400 mg/L納米鋅滅活組菌體抗原性顯著低于對(duì)照組，而在37 ℃條件下除50 mg/L濃度組外，其它3個(gè)濃度滅活組抗原性均顯著低于對(duì)照組。在4和28 ℃條件下，不同濃度納米鋅滅活菌體的抗原性沒(méi)有顯著性差異，而在37 ℃條件下,不同濃度納米鋅滅活菌體的抗原性受到不同程度的影響，其中400 mg/L納米鋅滅活組菌體抗原性顯著低于50 mg/L滅活組(見(jiàn)圖3)。

圖3 不同滅活條件對(duì)殺鮭氣單胞菌菌體抗原性的影響

2.3 殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗的免疫保護(hù)力

根據(jù)以上結(jié)果，從滅活效率及疫苗抗原性保持的效果出發(fā)，選擇100 mg/L-28 ℃為殺鮭氣單胞菌納米鋅滅活疫苗制備條件。為了比較納米鋅與甲醛滅活全菌疫苗的免疫保護(hù)效果，在免疫后40 d以殺鮭氣單胞菌活菌進(jìn)行攻毒。攻毒后，注射生理鹽水組的魚(yú)體在攻毒后第2天便開(kāi)始出現(xiàn)死亡，并且魚(yú)體在接下來(lái)的一周內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，直至攻毒后第10天死亡率達(dá)到96.7%。2個(gè)免疫組魚(yú)體的死亡率顯著低于對(duì)照組，在攻毒后第10天納米鋅與甲醛滅活菌體免疫組魚(yú)體的死亡率分別為13.3%與20%，計(jì)算其免疫保護(hù)率分別為86.2%與79.3%，2個(gè)免疫組均表現(xiàn)出較好的免疫保護(hù)效果(見(jiàn)圖4)。攻毒受感的魚(yú)體表現(xiàn)出腹鰭基部充血發(fā)紅、肛門(mén)突出、肌肉出血、腸道出血等殺鮭氣單胞菌感染的典型臨床癥狀，并能從受感死亡魚(yú)體中再次分離到該菌株。

圖4 納米鋅與甲醛滅活的殺鮭氣單胞菌菌苗的免疫保護(hù)效果

2.4 納米鋅對(duì)鯉上皮瘤(EPC)的細(xì)胞毒性

將懸浮的EPC細(xì)胞與不同濃度的納米鋅溶液混合后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀(guān)察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，如表2所示，高濃度1 600 mg/L納米鋅溶液會(huì)影響細(xì)胞的正常貼壁，低于800 mg/L濃度的納米鋅溶液不會(huì)影響細(xì)胞正常貼壁(見(jiàn)圖5)，但是800 mg/L濃度納米鋅處理后的細(xì)胞逐漸收縮脫壁趨于死亡(見(jiàn)圖5)；利用阿爾瑪藍(lán)指示劑測(cè)定6 d后EPC細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，濃度低于400 mg/L納米鋅溶液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝無(wú)顯著影響，濃度高于800 mg/L納米鋅溶液會(huì)影響細(xì)胞正常增殖代謝。

表2 不同濃度納米鋅對(duì)EPC細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)的影響

Note：①Concentration of anometer zinc；②Cell adherence after 12 h；③Cell growth after 3 d；④Cell viability after 6 d

(A. 400 mg/L納米鋅孵育后細(xì)胞正常貼壁；B. 1 600 mg/L納米鋅孵育后細(xì)胞無(wú)法貼壁；C. 400 mg/L納米鋅孵育后3天細(xì)胞正常生長(zhǎng)；D. 1 600 mg/L納米鋅孵育后3天細(xì)胞死亡。標(biāo)尺=20 μm。A. normal adherence of cells post incubation with 400 mg/L Nano-Zn; B. un-adherent cells post incubation with 1 600 mg/L Nano-Zn; C. Normal growth of cells on day 3 post incubation with 400 mg/L Nano-Zn; D. all cells died on day 3 post incubation with 1 600 mg/L Nano-Zn. Bar=20 μm.)

圖5 不同濃度納米鋅作用下的EPC細(xì)胞形態(tài)

Fig.5 The EPC cell morphology under different concentrations of nanometer zinc

3 討論

納米鋅是一種新型高功能精細(xì)無(wú)機(jī)材料，粒徑在1～100 nm之間，因其特有的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀(guān)量子隧道效應(yīng)，使得納米鋅具有無(wú)法比擬的特殊性能和用途，其在中性環(huán)境中無(wú)需光照即可表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，目前該材料已逐漸被應(yīng)用于醫(yī)療、保健、衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域，已成為無(wú)機(jī)抗菌劑研究的熱點(diǎn)[13]。本文首次將納米鋅材料作為水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的滅活劑進(jìn)行嘗試使用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌具有明顯的殺滅效果，其殺菌活性的強(qiáng)弱與納米鋅的濃度密切相關(guān)。前期研究結(jié)果同樣顯示，在納米鋅粒徑相同的情況下，其抗菌活性會(huì)隨著濃度的增加而增強(qiáng)[14]。前期研究還表明相同濃度納米鋅對(duì)不同種類(lèi)的細(xì)菌具有不同的抑殺效果，Xie等[15]比較研究了納米鋅對(duì)4種食物源性病原菌的抑殺效果，結(jié)果顯示納米鋅在0.5 mg/mL的濃度下即可在3 h內(nèi)滅活108CFU/mL的空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)，相比而言大腸桿菌O157∶H7對(duì)納米鋅的殺菌活性具有更強(qiáng)的耐受性。高艷玲等[16]也研究證實(shí)，納米鋅對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的抑制能力最強(qiáng)，其次是傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，然而對(duì)李氏桿菌(Listeriamonocytogenes)沒(méi)有明顯抑制作用。本研究結(jié)果顯示不同濃度的納米鋅在不同溫度條件下均能有效滅活殺鮭氣單胞菌，只是在滅活時(shí)長(zhǎng)上存在一定差異。分析造成納米鋅對(duì)不同細(xì)菌滅活效果差異的原因，一方面是由于菌種本身的遺傳特性差異決定其對(duì)納米鋅的耐受度不同，也有可能會(huì)由于不同學(xué)者使用的納米鋅顆粒的粒徑差異影響其抗菌活性。前期已有研究發(fā)現(xiàn)納米鋅抗菌效果與粒徑大小相關(guān)，一般認(rèn)為是粒徑越小的納米鋅抗菌活性越強(qiáng)[17-19]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活能力有著顯著的提升，然而目前有關(guān)溫度影響納米鋅抗菌活性的機(jī)理未有研究報(bào)道，我們推測(cè)升高溫度可促進(jìn)納米鋅與細(xì)菌生物大分子的互作，進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞生物活性分子的破壞[20]。

利用理化方法滅活制備全菌疫苗都會(huì)不同程度地對(duì)菌體抗原性造成破壞，進(jìn)而降低疫苗的免疫原性與免疫保護(hù)效果[21]，因而如何最大限度地保留菌體抗原性是一切滅活策略應(yīng)該首要考慮的技術(shù)問(wèn)題。本研究結(jié)果顯示，各濃度納米鋅在不同溫度條件下滅活處理并未造成菌體蛋白的明顯缺失與變化，說(shuō)明利用納米鋅殺滅菌體是一種相對(duì)溫和的滅活方法。然而，掃描電鏡與ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)高濃度納米鋅在高溫條件下處理菌體，可不同程度地對(duì)引起菌體破損，且免疫原性也會(huì)在一定程度上受到影響。高濃度納米對(duì)菌體抗原性的影響可能與其抗菌機(jī)理密切相關(guān)，已有研究證實(shí)，納米鋅的抗菌機(jī)理主要存在4種可能的方式：(1)通過(guò)釋放的離子與帶電的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電相互作用；(2)鋅離子的釋放或活性氧(ROS)的形成造成細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞；(3)鋅離子或者ROS的形成破壞細(xì)菌細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)合成；(4)由于膜的破壞，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏可導(dǎo)致細(xì)胞膜收縮，細(xì)胞裂解[22]。因而，在利用納米鋅制備全菌滅活疫苗時(shí)，還應(yīng)該基于菌體破壞情況及抗原影響情況選擇最為溫和、高效的滅活策略。

納米鋅由于其具有良好的生物相容性，對(duì)人體、養(yǎng)殖動(dòng)物及環(huán)境無(wú)毒害作用，加之其具有抗紅外、紫外和殺菌的功能，在很多領(lǐng)域尤其是在與人類(lèi)生存和健康密切相關(guān)的方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將會(huì)給人類(lèi)的醫(yī)療和健康帶來(lái)巨大的貢獻(xiàn)[20]。目前評(píng)價(jià)納米材料生物毒性的方法包括體內(nèi)和體外2種，其中體外評(píng)價(jià)是一種重要的毒性檢測(cè)手段，一般以組織或細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，這種檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、組間差異小[23-24]。本研究主要從體外細(xì)胞貼壁、形態(tài)以及細(xì)胞活性三個(gè)方面，評(píng)價(jià)了納米鋅對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，濃度低于400 mg/L的納米鋅溶液對(duì)魚(yú)類(lèi)EPC細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝無(wú)顯著影響，而該濃度水平的納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌卻能表現(xiàn)出較強(qiáng)滅活效果，說(shuō)明納米鋅對(duì)生物細(xì)胞具有一定的選擇毒性。石慧等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在半滑舌鰨飼料中添加適量的納米鋅可不同程度地提升魚(yú)體胰臟及腸道消化酶的活性，而未對(duì)魚(yú)體健康狀態(tài)產(chǎn)生明顯的毒副作用。另有研究顯示，在半滑舌鰨基礎(chǔ)飼料中添加納米鋅時(shí)，既可以提高半滑舌鰨的生長(zhǎng)性能，又可以提高其非特異性免疫力，同時(shí)對(duì)其肝臟影響較小[26]。因此，利用低濃度的納米鋅作為滅活劑應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)全菌滅活疫苗的制備不會(huì)存在安全性問(wèn)題。

當(dāng)前世界范圍內(nèi)，全菌滅活疫苗仍是開(kāi)展細(xì)菌性疫病免疫防控的主流免疫制劑，因此篩選一種安全有效的滅活制劑建立科學(xué)高效的滅活策略對(duì)于促進(jìn)全菌滅活疫苗的研制與應(yīng)用具有重要價(jià)值。甲醛是目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)滅活劑，但是由于其在安全性及滅活效果方面存在一定的不足[7], 因此篩選較甲醛更優(yōu)良的滅活劑具有重要的實(shí)際意義。本研究結(jié)果顯示，納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌具有良好的滅活效果，且免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米鋅滅活全菌疫苗顯示出較甲醛滅活全菌疫苗更好的免疫保護(hù)效果，說(shuō)明納米鋅滅活對(duì)菌體抗原性的破壞較甲醛更為溫和，且用于滅活的納米鋅濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其毒性濃度，從疫苗制備工藝及安全性上也優(yōu)于甲醛。

4 結(jié)語(yǔ)

本文研究了納米鋅對(duì)殺鮭氣單胞菌的滅活作用及其細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)納米鋅是一種安全、優(yōu)良的疫苗滅活劑，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果為高效、安全漁用滅活疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)和參考。