基于四級(jí)桿/靜電場軌道高分辨質(zhì)譜技術(shù)的葡萄酒鑒別研究

宓捷波，王飛，趙孔祥，劉旸，常春艷，鄭文杰

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

自20世紀(jì)90年代開始，葡萄酒作為一種承載文化和健康養(yǎng)生理念的載體逐漸受到全世界人們的青睞[1]。近年來，我國的葡萄酒消費(fèi)也呈逐年上升趨勢，據(jù)海關(guān)統(tǒng)計(jì)，我國的進(jìn)口葡萄酒數(shù)量幾乎以每年50%的速度飛速增長。然而，隨著大量葡萄酒的涌入，品牌混亂，價(jià)格虛高，原產(chǎn)地造假和品質(zhì)參差不齊等問題也不斷出現(xiàn)[2]。而葡萄酒作為直接飲用的食品，其品質(zhì)質(zhì)量必然會(huì)直接影響飲用者的健康和體驗(yàn)，因此，如何對(duì)葡萄酒進(jìn)行品質(zhì)產(chǎn)區(qū)鑒別一直是國內(nèi)外學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)[3]。

葡萄酒的鑒別技術(shù)目前主要集中于礦質(zhì)元素[2，4]、穩(wěn)定同位素[5-8]、香氣成分[9-10]和多酚類[11-12]物質(zhì)的分析。其中，多酚類物質(zhì)是決定葡萄酒色澤、苦味和收斂性等感官特性的重要物質(zhì)[13-15]，同時(shí)其含量差異也具有品種、工藝和地區(qū)的特征，因此，多酚類物質(zhì)的檢測分析對(duì)葡萄酒鑒別具有重要的意義。目前，葡萄酒中多酚類物質(zhì)的檢測大多采用液相色譜法（high pressure liquid chromatograph，HPLC）[16-19]和液相色譜質(zhì)譜法[20-23]，HPLC法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但對(duì)于結(jié)構(gòu)相近的多酚類物質(zhì)定性和區(qū)分能力稍差，而液相色譜質(zhì)譜方法定性區(qū)分能力強(qiáng)，應(yīng)用更為廣泛。本研究借助四級(jí)桿/靜電場軌道高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立葡萄酒中13種多酚類物質(zhì)的檢測方法，同時(shí)結(jié)合多元分析統(tǒng)計(jì)技術(shù)對(duì)來自不同產(chǎn)區(qū)國家的54批次葡萄酒的多酚類物質(zhì)進(jìn)行檢測和分析，通過構(gòu)建判別分析模型完成了龍膽酸、香草酸、白藜蘆醇等關(guān)鍵指標(biāo)函數(shù)的確立，初步實(shí)現(xiàn)了葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)區(qū)的鑒別，為有效監(jiān)管和分析葡萄酒產(chǎn)品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高壓液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（配有VIM閥切換和多柱切換模塊）：美國Thermofisher公司；Avanti J-30I高速冷凍離心機(jī)：美國Beckerman Coulter公司；MS3 basic渦旋混合器、HS 501振蕩反應(yīng)器：美國IKA Weake公司；Xcel VapTM自動(dòng)氮吹濃縮儀：美國Horizon公司；乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸：色譜純，德國Merck公司；兒茶素、槲皮素二水合物、沒食子酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、P-香豆素、芥子酸、白藜蘆醇等標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma-Aldrich公司；濃鹽酸（36%～38%）：分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司；試驗(yàn)一般用水為去離子水。

1.2 樣品前處理

取1 mL葡萄酒與9 mL去離子水混合，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=2，加入3 mL乙酸乙酯，振蕩提取10 min，3 500 r/min離心5 min，取上清液至15 mL離心管中，重復(fù)提取3次，合并提取液，于30℃水浴中氮吹至干，用10 mL含50%甲醇水溶液復(fù)溶。取100 μL復(fù)溶液，與900 μL含50%甲醇水溶液混合，過0.22 μm尼龍濾膜后進(jìn)樣檢測。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm），流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，流動(dòng)相A為含0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，洗脫程序：0～1 min，A 保持 95%，1 min～10 min，A 由 95%變化為10%，10 min～14 min，A保持95%。

質(zhì)譜條件：采用全掃描（full scan）和目標(biāo)離子二級(jí)掃描（Target MS2）結(jié)合方式，負(fù)離子模式，全掃描離子范圍：100 m/z～500 m/z，分辨率35 000，質(zhì)量偏差0.000 5%。鞘氣流速：0.72 L/min，輔助氣流速：3.3L/min，噴霧電壓：2.75 kV，毛細(xì)管溫度：280℃，離子源加熱溫度：350℃，總碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：35 eV。高分辨質(zhì)譜離子信息及碰撞能量見表1。利用全掃描結(jié)果外標(biāo)法定量，Target MS2結(jié)果定性。

表1 13種多酚類物質(zhì)的HPLC-QE HRMS質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of HPLC-QE HRMS for 13 polyphenols

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將得到的多酚類物質(zhì)的數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)若干因素對(duì)待預(yù)測對(duì)象進(jìn)行分類，通過分析構(gòu)建用于定性預(yù)報(bào)的數(shù)學(xué)模型，再利用構(gòu)建模型之外的派生數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

首先確立干紅-干白，新舊世界通常將歐洲等采用傳統(tǒng)技術(shù)釀制葡萄酒的產(chǎn)區(qū)稱為舊世界葡萄酒產(chǎn)區(qū)，而美洲、亞洲等采用新技術(shù)釀制葡萄酒的產(chǎn)區(qū)則被稱為新世界產(chǎn)區(qū)。歐美亞不同洲別和不同國別4個(gè)待預(yù)測類別組，利用主成分分析、偏最小二乘法等判別分析方法，以所有13種多酚成分的相對(duì)濃度含量為自變量，研究這些化合物相對(duì)含量對(duì)上述4個(gè)待預(yù)測類型組的判別能力，從中獲得表征類別差異的化合物組；借助差異化學(xué)成分構(gòu)建判別模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

多酚類物質(zhì)通常是具有帶一個(gè)或多個(gè)羥基的芳環(huán)結(jié)構(gòu)，在負(fù)離子模式下檢測可獲得較強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)[24-25]。依據(jù)負(fù)離子模式檢測時(shí)物質(zhì)離子化的特點(diǎn)，若流動(dòng)相中含酸會(huì)抑制目標(biāo)物的離子化，所以一般以水為流動(dòng)相。但以甲醇和水為流動(dòng)相時(shí)，多酚類物質(zhì)在色譜柱上有嚴(yán)重的拖尾，而加入少量的乙酸后，多酚類物質(zhì)的峰形有了明顯改善。所以為了同時(shí)兼顧多酚類物質(zhì)的峰形和響應(yīng)值，分別在流動(dòng)相中添加0.1%、0.2%、0.5%、1.0%的乙酸進(jìn)行測定，結(jié)果表明，含0.5%乙酸的水溶液與甲醇為流動(dòng)相時(shí)多酚類物質(zhì)的響應(yīng)最佳。故最終以0.5%乙酸水與甲醇作為多酚類物質(zhì)的流動(dòng)相。圖1為0.5%乙酸水溶液與甲醇作為流動(dòng)相時(shí)13種多酚類物質(zhì)的提取離子色譜圖，峰形和響應(yīng)值均可滿足分析的需要。

圖1 葡萄酒中13種多酚類物質(zhì)的全掃描提取離子色譜圖Fig.1 Full scan chromatograms of 13 polyphenols in wine

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

試驗(yàn)結(jié)果顯示，13種多酚類物質(zhì)在0.001 mg/L～10 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以不同水平稀釋后分析化合物響應(yīng)的信噪比（S/N）大于10計(jì)算方法的定量下限，得到各物質(zhì)的定量下限為0.000 5 mg/L～0.002 5mg/L。文獻(xiàn)[16-17]研究表明，每升葡萄酒中上述多酚類物質(zhì)的含量一般為mg級(jí)，所以，本方法的靈敏度可以滿足葡萄酒中多酚類物質(zhì)稀釋100倍后的檢測需要。同時(shí)，方法在低、中、高添加水平的加標(biāo)回收率為78.7%～109.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.8%～9.5%。

2.3 多酚指標(biāo)對(duì)干白和干紅的判別

采用四級(jí)桿/靜電場軌道高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)來自美洲、歐洲、非洲、亞洲和大洋洲的12個(gè)國家共54批次的干紅和干白葡萄酒進(jìn)行13種多酚類物質(zhì)的測定，對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)以預(yù)測“干白-干紅”為目標(biāo)進(jìn)行分析。表2為各酚酸指標(biāo)對(duì)于“干白-干紅”類別組的均值差異情況。

表2 干紅、干白的判別分析結(jié)果Table 2 Results of squares discriminant analysis based on red wine and white wine

從表2中可以看出沒食子酸、兒茶素、龍膽酸和香草酸在不同類型的葡萄酒樣品中差異很顯著（F值較大），因此在利用這些成分辨別葡萄酒的不同類型（干白或干紅）時(shí)，它們是重要的參數(shù)。

一般而言，判別分析中sig值小于0.05即可判斷為顯著水平，故本試驗(yàn)中以龍膽酸和香草酸構(gòu)建進(jìn)一步的Fisher判別函數(shù)。

將原始數(shù)據(jù)代回上述公式中，實(shí)際樣品數(shù)據(jù)的正確率為96.2%?？梢姡迷摵瘮?shù)模型對(duì)干白和干紅的類別分析較為有效，與直觀的結(jié)果分析也十分一致。

2.4 多酚指標(biāo)對(duì)新世界產(chǎn)區(qū)和舊世界產(chǎn)區(qū)的判別

本試驗(yàn)對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)以預(yù)測“新舊世界產(chǎn)區(qū)”為目標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 新世界、舊世界產(chǎn)區(qū)的判別分析結(jié)果Table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

續(xù)表3 新世界、舊世界產(chǎn)區(qū)的判別分析結(jié)果Continue table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)在葡萄酒樣品中差異都不顯著（Sig值都大于0.05），因此不能夠利用這些多酚數(shù)據(jù)辨別葡萄酒的新舊世界產(chǎn)區(qū)。

2.5 多酚指標(biāo)對(duì)洲別的判別

鑒于通常歐洲、美洲、大洋洲和其他洲之間的葡萄酒也會(huì)存在工藝、品種上的差異，因此本試驗(yàn)將“洲別”也作為一個(gè)預(yù)測組，分析結(jié)果見表4。

表4 不同洲別產(chǎn)區(qū)的判別分析結(jié)果Table 4 Results of squares discriminant analysis based on different continents

結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍膽酸和白藜蘆醇在不同洲別葡萄酒樣品中差異很顯著。按2.3所述構(gòu)建fisher判別函數(shù)并借助方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，對(duì)分組葡萄酒樣品中的55.3%進(jìn)行了正確分類。所以，該模型可用于葡萄酒洲產(chǎn)區(qū)的初步區(qū)分。

2.6 多酚指標(biāo)對(duì)國別的判別

本試驗(yàn)利用同樣的判別分析方法以“國家”為預(yù)測組進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 不同國家產(chǎn)地的判別分析結(jié)果Table 5 Results of squares discriminant analysis based on different countries

結(jié)果顯示p-香豆素在該預(yù)測分類組的葡萄酒樣品中差異很顯著。按2.3所述構(gòu)建fisher判別函數(shù)并借助方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型只能對(duì)以國別分組的葡萄酒樣品中的27.7%進(jìn)行正確的國別分類，所以該預(yù)測組模型對(duì)于國家的區(qū)分度相對(duì)不高。

3 結(jié)論

本研究借助四級(jí)桿/靜電場軌道高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立葡萄酒中13種多酚類物質(zhì)的檢測方法，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)復(fù)雜的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行類別區(qū)分，結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)對(duì)干白、干紅的區(qū)分性很好，數(shù)學(xué)模型的吻合度非常高，對(duì)產(chǎn)區(qū)洲別的吻合度約50%，基本實(shí)現(xiàn)了初步區(qū)分的目的?？紤]到酒樣真實(shí)性無法確切保證，上述結(jié)果也在預(yù)期之內(nèi)，但利用酚酸類物質(zhì)進(jìn)行分析產(chǎn)區(qū)的基本模式是可行的，如果在進(jìn)一步的試驗(yàn)中增加指標(biāo)參數(shù)，再配合真實(shí)性可靠的酒樣，應(yīng)該會(huì)有更好的結(jié)果。