超聲波輔助提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑工藝的研究

任秀娟

（1.山東商務(wù)職業(yè)學院食品工程系，山東煙臺264670；2.山東商務(wù)職業(yè)學院糧油食品工程技術(shù)研發(fā)中心，山東煙臺264670）

根據(jù)世衛(wèi)組織研究報道，中國當前超重人口超過3億，已成為擁有超重人口最多的國家，而且這個數(shù)字還在飛速增長。科研人員發(fā)現(xiàn)[1]肥胖病人患高血壓、高血脂、心腦血管等疾病的概率比一般人要高。肥胖往往和人們攝入過多高脂、高熱量食物有關(guān)，降低脂肪攝入，可以有效降低體重。人體攝入的脂肪先通過消化系統(tǒng)中的胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL）水解[1]，然后被吸收轉(zhuǎn)換成能量。在脂肪水解過程中，胰脂肪酶作為重要的水解酶可以把油脂水解為甘油和單分子脂肪酸[2]，因此抑制或降低體內(nèi)胰脂肪酶的活性可以對脂肪的水解和吸收進行抑制，以此達到減重和控制肥胖的目的[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種能抑制脂肪酶活性的功能成分，如黃酮類物質(zhì)[4-7]、多酚類物質(zhì)[8-10]、香水蓮花提取物[11]等，但目前還未有綠茶中脂肪酶抑制劑提取的報道。

國內(nèi)外對綠茶的諸多研究表明，綠茶中的活性成分具有調(diào)節(jié)血脂[12-13]和控制肥胖[14-15]等多種保健功能，在嶗山綠茶中提取分離能抑制脂肪酶活性的功能性成分，并優(yōu)化其提取工藝，不但可以改善目前日益嚴重的人群肥胖問題，對開發(fā)綠茶資源進而服務(wù)新舊動能轉(zhuǎn)換也具有重大的意義。

超聲波對生物細胞有破壞作用[16]，可以強化萃取系統(tǒng)物質(zhì)的傳遞作用，與傳統(tǒng)溶劑法提取工藝相比，能使有效成分更好的溶出[17]。該文對萃取液施加超聲波，對超聲波輔助提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的影響因素進行探討，并篩選出較佳的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嶗山綠茶：市售，曬干后粉碎，備用；豬胰脂肪酶（酶活≥30 000 U/g）：Sigma公司；硝基苯基月桂酸酯底物溶液（P-nitropenyl laurate，pNPL）：月桂酸 4-硝基苯酯：安徽酷爾生物工程有限公司；pH 7.5磷酸緩沖液（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

LTB-1000數(shù)顯溫控超聲波清洗機：濟寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司；RE-2001A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；ZNCL-GS磁力攪拌器：上海一科儀器有限公司；2-16N高速常溫離心機：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；5202P型數(shù)顯pH計：登科普瑞（北京）科技有限公司；DNM-9606酶標分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胰脂肪酶活性檢測方法

37℃恒溫下，把底物與胰脂肪酶放置3 min，底物1 min內(nèi)釋放1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位，U。

在試管中加入pH 7.5的磷酸緩沖溶液350 μL、450 μL pNPL底物、樣品溶液 50 μL，37℃預熱 10 min后加入 150 μL 胰脂肪酶（0.2 mg/mL），混勻，37℃避光反應(yīng)60 min，16 000 r/min離心3 min，取上清于405 nm波長測吸光度[18-19]。用緩沖溶液代替樣品液做對照組做3次平行試驗。抑制率按公式（1）進行計算率。

式中：A1、A2分別為對照組和不同樣品溶液在405 nm處的吸光度。

1.3.2 嶗山綠茶提取物得率的計算

提取物冷凍干燥后，稱量，按公式（2）計算提取物的得率。

式中：Y 為提取物得率，%；m′為提取物質(zhì)量，g；m為嶗山綠茶質(zhì)量，g。

1.3.3 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑活性部位篩選

取粉碎后的嶗山綠茶1 kg，按1∶7（g/mL）的料液比加入95%乙醇，浸提3次，每次半小時。濃縮提取液，按1∶3（g/mL）的料液比分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至有機層無色，濃縮并冷凍干燥各有機相提取物，配成所需濃度后按1.3.1所述方法測定各極性溶劑提取物的抑酶活性。

1.3.4 超聲波提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的單因素試驗

稱取20 g嶗山綠茶6份于燒杯中，置于超聲清洗儀中超聲提取，分別對乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時間等影響因素進行單因素試驗，把得到的浸提液進行濃縮，再用有機溶劑萃取，冷凍干燥有機溶劑萃取液，干燥后的粉末物質(zhì)即為嶗山綠茶中抑制脂肪酶的活性成分[20-21]。

1.3.4.1 乙醇濃度對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比分別加入 20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，30℃下超聲浸提 30 min，超聲波功率為300 W。測量超聲波下不同濃度乙醇對提取物的得率和對脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.2 超聲功率對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，設(shè)不同超聲功率（100、200、300、400、500、600 W）在 30 ℃下提取30 min。測量不同超聲功率對提取物的得率和對脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.3 超聲提取溫度對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，不同溫度下（20、30、40、50、60、70 ℃）下超聲提取 30 min，超聲功率為300 W。測量不同提取溫度對提取物的得率和對脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.4 超聲提取時間對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以 1∶15（g/mL）料液比加入 60%乙醇，30℃下超聲提取若干分鐘（10、20、30、40、50、60 min），超聲功率為300 W。測量不同提取時間對提取物的得率和對脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.5 提取工藝的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以脂肪酶抑制劑的得率和抑制率為指標，以乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時間作為正交試驗的考察因素，選用L9（34）正交試驗，因素和水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗的因素和水平Table 1The factors and levels of L9（34）orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑活性部位篩選

不同溶劑提取物對脂肪酶活性的抑制作用見圖1。

圖1 不同溶劑提取物對脂肪酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of different solvent extracts on lipase activity

由圖1可見，5種不同極性提取物對脂肪酶活性的抑制作用從大到小依次為：乙酸乙酯提取物>水相提取物>正丁醇提取物>氯仿提取物>石油醚提取物。其中乙酸乙酯提取物的抑制效果顯著，當提取物濃度為10 mg/mL時，對脂肪酶活性的抑制率可達89.3%。不同溶劑提取物抑制脂肪酶活性的IC50見表2。

表2 不同溶劑提取物抑制脂肪酶活性的IC50Table 2 IC50of different solvent extracts to inhibit lipase activity

根據(jù)圖1計算得出不同極性溶劑提取物對脂肪酶活性的抑酶IC50，如表2所示，乙酸乙酯提取物對脂肪酶活性的抑制效果最好，石油醚提取物抑制效果最差。因此選擇用乙酸乙酯作為超聲提取脂肪酶抑制劑工藝的萃取劑。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測量不同濃度乙醇條件下提取物的得率和對脂肪酶的抑制率見圖2。

圖2 乙醇濃度對脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖2可知，脂肪酶抑制劑的得率隨著乙醇濃度的增加而增加，但當乙醇濃度大于50%時，得率增加不大；脂肪酶抑制劑的抑制率在乙醇濃度為50%時最大，高于50%時抑制率反而下降，這可能是因為隨著乙醇濃度增加，非抑制成分醇溶物增加，雖然得率增加，但抑制劑含量下降，從而導致抑制率下降。

2.2.2 超聲功率對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測量不同超聲功率下提取物的得率和對脂肪酶的抑制率見圖3。

圖3 超聲功率對脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖3可知，提取物得率和對脂肪酶的抑制率都在400 W時達到最大。這是因為隨著超聲功率增加，熱效應(yīng)也逐漸加強，脂肪酶抑制劑的活性降低。

2.2.3 超聲提取溫度對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測量不同超聲提取溫度下提取物的得率和對脂肪酶的抑制率見圖4。

圖4 提取溫度對脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖4可知，提取物得率與提取溫度成正比，而抑制率隨著溫度升高先增加后降低，在40℃時抑制率最大。可見，溫度升高雖然可增加得率，但卻使脂肪酶抑制劑降低了活性。

2.2.4 超聲提取時間對脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

超聲提取時間對提取物的得率和對胰脂肪酶活性的抑制率的影響如圖5所示。

由圖5可知，提取率隨時間不同而不同，如果超聲提取時間過短，則有效成分來不及從綠茶細胞中溶出，影響提取率，但當綠茶中脂肪酶抑制劑基本浸出完畢后，增加提取時間對得率影響不大，其抑制率反而有所下降，因為活性成分在溶液中長時間受熱可能使部分結(jié)構(gòu)被破壞。從圖5可以看出超聲提取20 min時抑制率最大。

圖5 超聲提取時間對脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on the yield and inhibitory rate of lipase inhibitors

2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時間4個影響提取工藝的因素進行正交試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 超聲提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test of ultrasonic extraction of lipase inhibitors from Laoshan green tea

由表3可以看出，影響提取物得率的因素的主次順序為A>D>B>C，即乙醇濃度對得率影響最大，其次是超聲提取時間，然后是超聲功率和超聲提取溫度。最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即用70%乙醇，超聲波功率為200 W，在50℃下超聲提取30 min。對于抑制劑抑制率，影響因素的主次順序為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度對抑制率影響最大，其次是超聲提取時間，然后是超聲功率和超聲提取溫度，最優(yōu)組合為A2B2C1D1，即用60%乙醇，超聲功率為300 W，在30℃下提取10 min。經(jīng)綜合評價，確定A2B2C1D1為最終優(yōu)化工藝條件。

2.4 驗證優(yōu)化工藝試驗

用60%乙醇，設(shè)定超聲功率為300 W，在30℃下超聲提取10 min，以此條件進行3次驗證試驗，結(jié)果見表4。

表4 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑最佳提取工藝條件Table 4 Verification of the optimum conditions for inhibitor

3次驗證試驗相對標準偏差值皆在2%之內(nèi)，說明此工藝穩(wěn)定性好。在此工藝條件下，提取物平均得率為29.2%，平均抑制率為79.2%。

3 結(jié)論

用不同極性溶劑對嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的活性部分進行篩選，水、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇組分對嶗山綠茶中脂肪酶抑制的IC50值分別為3.95、9.64、34.73、0.69、21.61 mg/mL，脂肪酶抑制劑重要集中在乙酸乙酯組分中，因此提取工藝先用乙醇提取，再用乙酸乙酯萃取。經(jīng)綜合評定，確定超聲波法法提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的最佳工藝條件為：用60%乙醇，超聲功率為300 W，在30℃下超聲提取10 min，得率和抑制率分別為29.2%和79.2%。與單純用溶劑浸提相比，超聲波輔助提取工藝提高了脂肪酶抑制劑的得率和抑制率，并大大縮短了提取時間。