雷艷,胡吉蕾,劉青青,胡剛,謝惠波,*
(1.西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,四川瀘州646000;2.瀘州市古藺金芒面條加工責(zé)任有限公司,四川瀘州646000)
近年來,隨著人們生活水平的提高和生活習(xí)慣的改變,我國高脂血癥的發(fā)病率明顯增加,患者逐漸趨向年輕化。目前中國居民慢性病報(bào)告數(shù)據(jù)顯示:我國高脂血癥患病率已達(dá)到40.4%,較高血壓、糖尿病增長速度更快。高脂血癥所引起的動(dòng)脈粥樣硬化是造成心血管疾病的主要原因之一,而目前心血管疾病是我國引起死亡人數(shù)最多的慢性病[1-2]。據(jù)報(bào)道,全世界每年死于心血管疾病的人數(shù)約有1700萬,預(yù)計(jì)到2030年死亡人數(shù)將達(dá)到2 360萬[3]。高脂血癥已經(jīng)成為危害我國人民健康、社會和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。臨床實(shí)踐表明,控制血漿總膽固醇和低密度脂蛋白是冠心病的一級預(yù)防和二級預(yù)防中的重要任務(wù)[4]。一般來講,傳統(tǒng)調(diào)脂藥物治療有一定的毒副作用[5-6],具有預(yù)防及輔助降低高血脂的功能性食物受到推崇和重視。
黃豆在我國資源豐富,且具有健脾降脂等保健功能;山藥、決明子是我國藥食同源類食物,山藥有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、延緩衰老等多種功效[7-9],決明子具有降血脂、清肝明目、潤腸通便的功效[10-12]。而掛面是我國的傳統(tǒng)主食之一,容易被人們接受,日常銷售量大。本實(shí)驗(yàn)研究決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響,為決明子山藥掛面的推廣提供一定的依據(jù)。
高脂飼料:68.5%基礎(chǔ)飼料、1.2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖、0.3%膽鹽。
低劑量配方高脂飼料:64.75%基礎(chǔ)飼料、1.2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖、0.3%膽鹽、0.75%決明子、1.5%黃豆、1.5%山藥。
中劑量配方高脂飼料:57.25%基礎(chǔ)飼料、1.2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖、0.3%膽鹽、2.25%決明子、4.5%黃豆、4.5%山藥。
高劑量配方高脂飼料:46%基礎(chǔ)飼料、1.2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖、0.3%膽鹽、4.5%決明子、9%黃豆、9%山藥;以上飼料均由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司購買原料并進(jìn)行制作。
雄性SD大鼠(100±10)g 60只:重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司;阿托伐他汀鈣片20 mg/盒:北京嘉林藥業(yè)股份有限公司;總膽固醇((total cholestero,TC)測定試劑盒、甘油三酯(triglyceride,TG)測定試劑盒、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)測定試劑盒、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。其余均為實(shí)驗(yàn)室常用化學(xué)試劑,市售分析純。
TD25-WS臺式低速自動(dòng)平衡離心機(jī):上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;WKYⅢ-1000型微量移液器:上海佳安分析儀器廠;美國zealway GI54DWS全自動(dòng)高壓滅菌箱:上海民儀電子有限公司;GRX-9073A干烤滅菌器、LRH-150生化培養(yǎng)箱:上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;VersaMax ROM v 2.0.16酶標(biāo)儀:美國Molecular Devices公司,其它均為實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿。
1.4.1 分組與飼養(yǎng)
本實(shí)驗(yàn)已獲得西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會的許可,大鼠按照西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)。室溫(25±2)℃,相對濕度55%~65%,換氣良好,籠具衛(wèi)生、無毒。將60只體重(100±10)g清潔級SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,按體重分為空白對照組10只及高脂模型組50只,空白對照組喂飼普通飼料,高脂模型組喂飼高脂飼料,喂養(yǎng)4周建立高脂血癥模型;高脂血癥大鼠按體重及TC值隨機(jī)分為高脂模型組、陽性對照組、低、中、高劑量復(fù)配組,每組10只,空白對照組繼續(xù)喂飼普通飼料,高脂模型組喂飼高脂飼料,陽性對照組喂飼高脂飼料并每天同一時(shí)間灌胃阿托伐他汀10 mg/kg,低、中、高劑量復(fù)配組分別喂飼摻有一定劑量決明子山藥黃豆的高脂飼料。飼養(yǎng)期間,所有大鼠自由攝食和飲水,每周換兩次鼠籠,每周稱量1次大鼠體重。
1.4.2 試樣的采集
大鼠喂養(yǎng)4周及6周后,于采血前禁食不禁飲12h,斷尾采血于標(biāo)號的1.5 mL離心管中,常溫下靜止2 h后于低速常溫離心機(jī)上3 000 r/min離心10 min,分離血清并檢測TC、TG。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠禁食不禁飲12h,以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)按腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血后處死,離心制備血清檢測TC、TG、HDL、LDL;立即取出肝臟,0.86%生理鹽水漂洗并用濾紙吸干表面水分后稱其濕重,計(jì)算肝體比[肝體比=肝臟質(zhì)量(g)/大鼠體重(g)];另取同一部位肝臟 10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE(hematoxylin-eosin)染色,光鏡下行組織學(xué)檢查。
1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,用LSD(least-significant difference)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P>0.05差異不顯著,P<0.05差異顯著。數(shù)值用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。
決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠體重的影響見表1。
表1可見,實(shí)驗(yàn)開始0周及4周各組大鼠的體重之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)6周及9周時(shí),陽性對照組及決明子山藥黃豆高劑量復(fù)配組的體重顯著低于空白對照組(P<0.05),低、中劑量復(fù)配組的體重也低于空白對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂模型組與其他各組大鼠的體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠體重的影響(n=10,±s)Table 1 The effect of cassia yam noodle on body weight of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
表1 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠體重的影響(n=10,±s)Table 1 The effect of cassia yam noodle on body weight of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
注:a為與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
組別 0周 2周 4周 6周 9周對照組 156.80±11.88 265.90±46.46 325.20±48.07 371.70±57.26 409.40±58.69高脂模型組 155.60±11.82 246.80±25.17 301.40±35.20 346.20±49.14 385.40±59.86陽性對照組 155.80±12.69 242.00±20.45 296.80±20.70 318.70±32.28a 362.50±25.99a低劑量復(fù)配組 158.00±11.83 247.50±21.67 301.80±24.30 338.90±36.65 371.11±44.30中劑量復(fù)配組 153.90±11.35 250.80±23.23 299.00±26.39 350.10±34.88 386.90±43.84高劑量復(fù)配組 155.30±9.02 244.20±21.13 296.00±21.67 313.67±29.94a 349.78±32.24a
決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠肝臟的影響見表2。
表2 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠肝臟的影響(n=10,±s)Table 2 Effect of cassia yam noodle on liver of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
表2 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠肝臟的影響(n=10,±s)Table 2 Effect of cassia yam noodle on liver of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
注:a為與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);b為與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
組別 肝體比(±s)對照組 0.023 8±0.001 8高脂模型組 0.028 4±0.003 4a陽性對照組 0.026 9±0.002 1a低劑量復(fù)配組 0.028 1±0.002 5a中劑量復(fù)配組 0.026 4±0.001 6ab高劑量復(fù)配組 0.028 4±0.001 9a
圖1 顯微鏡下各組大鼠肝臟脂肪病變組織學(xué)變化(HE染色,×400)Fig.1 Histological changes of hepatic fat lesions in rats in each group under microscope(HE staining,×400)
表2可見,與對照組相比,高脂模型組、陽性對照組及低、中、高劑量復(fù)配組的肝體比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中高脂模型組及高劑量復(fù)配組肝體比最大。與高脂模型組相比,陽性對照組及低、中劑量復(fù)配組的肝體比均有降低,但只有中劑量復(fù)配組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
顯微鏡下各組大鼠肝臟脂肪病變組織學(xué)變化見圖1,組織為HE染色,放大倍數(shù)為400倍。
肉眼觀察對照組肝臟鮮紅,邊緣銳利,質(zhì)韌富有彈性。高脂模型組肝臟腫大,包膜光滑,邊緣圓鈍,組織表面顏色變黃,觸之質(zhì)如泥塊有油膩感。經(jīng)阿托伐他汀及各劑量組決明子山藥黃豆復(fù)配干預(yù)后,各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟可見略增大,色微黃,散在分布,部分大鼠肝臟肉眼觀察無明顯改變。光鏡檢查發(fā)現(xiàn):對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索狀排列,肝竇無明顯擴(kuò)張或狹窄,肝細(xì)胞核居中,胞漿豐富,胞膜清晰,HE染色胞漿紅染。高脂模型組肝竇明顯狹窄,肝索排列較紊亂,HE染色部分肝細(xì)胞增大或腫脹,胞漿內(nèi)密布脂滴空泡。阿托伐他汀及決明子山藥黃豆中、高劑量復(fù)配組肝細(xì)胞索狀排列,肝竇無明顯狹窄,HE染色見小葉周邊部肝細(xì)胞體積稍增大,胞漿淺染,少量肝細(xì)胞內(nèi)見細(xì)小脂滴,少量肝細(xì)胞水腫。決明子山藥黃豆低劑量復(fù)配組肝細(xì)胞胞質(zhì)中雖仍可見大小不等的脂肪滴空泡,部分細(xì)胞或因脂肪變性發(fā)生腫大,細(xì)胞核稍偏離正常位置。
決明子山藥黃豆復(fù)配對大鼠TC、TG的動(dòng)態(tài)影響見表3。
表3 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠TC、TG的動(dòng)態(tài)影響(n=10,±s)Table 3 Dynamic effect of semen cassia yam soybean on TC and TG in hyperlipidemia rats(n=10,±s)
表3 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠TC、TG的動(dòng)態(tài)影響(n=10,±s)Table 3 Dynamic effect of semen cassia yam soybean on TC and TG in hyperlipidemia rats(n=10,±s)
注:a為與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);b為與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
TG 4周 6周 9周 4周 6周 9周對照組 1.74±0.39 1.75±0.36 1.85±0.27 0.62±0.14 0.66±0.14 0.67±0.18高脂模型組 2.49±0.29a 2.41±0.33a 2.55±0.60a 0.85±0.10a 0.86±0.23a 0.87±0.22a陽性對照組 2.41±0.44a 2.05±0.39b 2.35±0.31a 0.79±.016a 0.80±0.16 0.80±0.12低劑量復(fù)配組 2.31±0.31a 2.59±0.40a 2.52±0.44a 0.75±0.11a 0.78±0.18 0.76±0.19中劑量復(fù)配組 2.48±0.29a 2.35±0.42a 2.17±0.33b 0.76±.014a 0.81±0.13 0.71±0.14b高劑量復(fù)配組 2.40±0.35a 2.31±0.23a 2.25±0.43a 0.75±0.14a 0.77±0.15 0.76±0.16組別 TC
由表3可以看出,喂養(yǎng)4周后大鼠高脂模型組、陽性對照組及低、中、高劑量復(fù)配組血清TC、TG均較對照組升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)6周后,高脂模型組及各劑量復(fù)配組的TC均較對照組升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與高脂模型組相比,陽性對照組的TC降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)9周后,高脂模型組、陽性對照組及低、高劑量復(fù)配組的TC均較對照組升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與高脂模型組相比,中劑量復(fù)配組的TC降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)6周后,高脂模型組TG較對照組升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陽性對照組及各劑量復(fù)配組TG較高脂模型組稍有降低,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)9周后,高脂模型組TG較對照組升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與高脂模型組相比,中劑量復(fù)配組的TG降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠HDL-C、LDL-C的影響見表4。
由表4可見,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,與對照組相比,高脂模型組及高劑量復(fù)配組的HDL均有升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對照組相比,高脂模型組的LDL升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與高脂模型組相比,低、中、高劑量復(fù)配組的LDL均有降低,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但3個(gè)劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表4 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠HDL-C、LDL-C的影響(n=10,±s)Table 4 Effect of semen cassia yam soybean on HDL-C and LDLC of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
表4 決明子山藥黃豆復(fù)配對高脂血癥大鼠HDL-C、LDL-C的影響(n=10,±s)Table 4 Effect of semen cassia yam soybean on HDL-C and LDLC of hyperlipidemia rats(n=10,±s)
注:a為與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);b為與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
組別 HDL LDL對照組 0.46±0.17 0.74±0.25高脂模型組 0.72±0.34a 0.95±0.21a陽性對照組 0.52±0.16 0.86±0.13低劑量復(fù)配組 0.65±0.26 0.70±0.26b中劑量復(fù)配組 0.60±0.21 0.69±0.23b高劑量復(fù)配組 0.72±0.21a 0.72±0.19b
本次實(shí)驗(yàn)依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的高脂血癥動(dòng)物模型制造方法,結(jié)合參考文獻(xiàn),最終確定了高脂血癥模型的飼料配方及決明子山藥黃豆復(fù)配低、中、高劑量。擬通過高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠造成高脂血癥,并在高脂血癥模型成功后,進(jìn)行阿托伐他汀和決明子山藥黃豆低、中、高劑量喂養(yǎng),于實(shí)驗(yàn)4、6、9周測定大鼠血脂指標(biāo),對決明子山藥黃豆的降脂功能進(jìn)行評價(jià)。
實(shí)驗(yàn)開始時(shí),各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,體重均衡,具有可比性。實(shí)驗(yàn)中,各組動(dòng)物生長發(fā)育良好,體重穩(wěn)定增加。喂養(yǎng)4周后,各組大鼠體重差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但高脂血癥模型的大鼠體重均較對照組降低,可能是飼料過于油膩、膽鹽具有苦味,飼料口感較差,對大鼠攝食量有所影響。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]:高脂鼠和肥胖鼠在定義上還是有區(qū)別的,血脂變化與體重變化并無相關(guān)性。喂養(yǎng)6周及9周后,陽性對照組及決明子山藥黃豆高劑量復(fù)配組大鼠體重均較低,且與對照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能的原因有:①灌胃阿托伐他汀刺激胃腸道導(dǎo)致飼料攝入減少;②高劑量復(fù)配中的決明子含量較多,由于決明子的瀉下作用,減少了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收并增加了營養(yǎng)物質(zhì)排泄。
肝體比增大說明肝臟組織發(fā)生增生肥大或水腫等。結(jié)合肝組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),過多的油脂攝入使脂肪積累,造成肝臟負(fù)擔(dān)加重或病變,肝臟質(zhì)量增加,從而使肝體比增加[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組肝體比均較對照組高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明阿托伐他汀及決明子山藥黃豆均只能一定程度降低血脂,不能逆轉(zhuǎn)高脂血癥。與高脂模型組相比,陽性對照組及中劑量復(fù)配組的肝體比均有降低,且中劑量復(fù)配組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而低、高劑量復(fù)配組的肝體比與高脂模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究顯示,添加膽固醇能增加大鼠肝臟,同時(shí)由于高劑量復(fù)配組決明子及黃豆的含量較高,可能引起肝臟代償性增大,從而導(dǎo)致高劑量復(fù)配組肝體比值的升高。低劑量復(fù)配組的決明子、黃豆及山藥的含量過少,摻入高脂飼料中進(jìn)行喂養(yǎng),降低血脂效果甚微,導(dǎo)致低劑量復(fù)配組的肝體比與高脂模型組相比無差異。
喂養(yǎng)4周后,與對照組相比,其他各組大鼠TC、TG的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明高脂血癥模型建立成功。陽性對照組的TC6周時(shí)下降明顯,與高脂模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但9周時(shí)升高。表明阿托伐他汀作為目前最常用的降脂藥物,它的降脂效果較迅速,這和袁泉發(fā)等的研究一致[16]。低、中、高劑量決明子山藥黃豆復(fù)配的降脂效果雖然不顯著,但6周、9周呈遞增下降,且9周末,中劑量決明子山藥黃豆的TC與高脂模型的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而低、中、高劑量決明子山藥黃豆復(fù)配的降脂效果沒有呈線性相關(guān),可能原因有:①低劑量的決明子、黃豆及山藥的含量過少有關(guān),再摻入高脂飼料中進(jìn)行喂養(yǎng),降低血脂效果甚微;②高劑量的決明子含量過多,味苦,大鼠攝入飼料減少,從而導(dǎo)致降脂效果不佳;③中劑量的決明子含量適中,加之飼料中摻入白砂糖,中和了決明子的苦味,使口感變好,增加飼料的攝入,從而增加了決明子、黃豆及山藥的攝入量含量,降脂效果甚佳。從長期降脂效果相比,中劑量決明子山藥黃豆的效果稍優(yōu)于阿托伐他汀。陽性對照組、各劑量決明子山藥黃豆的TG與高脂模型組相比均有不同程度的下降,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與阿托伐他汀及決明子降脂原理有關(guān):他汀類藥物是膽固醇合成限速酶即HGMCoA還原酶的抑制劑[17-18],其降膽固醇作用主要是通過促LDLR啟動(dòng)子活性并增加其表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。而決明子含有大黃素、葡萄糖苷等具有導(dǎo)瀉作用的物質(zhì),能增加排泄及減少腸道對膽固醇的吸收,通過反饋調(diào)節(jié)低密度脂蛋白代謝,降低血清膽固醇水平[19-20]。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,與對照組相比,其他各實(shí)驗(yàn)組大鼠HDL均上升,其中高脂模型組及高劑量決明子山藥黃豆的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異??赡苁歉咧暳吓浞街泻幸欢康牡包S,許多研究顯示雞蛋攝入與體內(nèi)HDL含量呈正相關(guān)性。低、中、高劑量決明子山藥黃豆復(fù)配組的LDL與高脂模型組相比均有下降,且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與決明子降脂原理有關(guān)。
依據(jù)2012年衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》輔助降血脂功能結(jié)果判定,各劑量組與模型對照組比較,任一劑量組血清TC或LDL-C降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且任一劑量組血清TG降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)各給藥劑量組血清HDL-C不明顯低于模型對照組,即可判定該受試樣品輔助降血脂功能結(jié)果為陽性。因此表明決明子山藥黃豆復(fù)配具有輔助降血脂的作用。