應用重組發(fā)光細菌評價水中環(huán)境污染物毒性的研究進展

曾祺雯

（福州大學，福州 351008）

1 水污染及污染物毒性檢測

1.1 污染現(xiàn)狀

過去，我國采用低經(jīng)濟成本、高環(huán)境成本的發(fā)展模式，導致環(huán)境污染問題日益加重，環(huán)境污染物毒性對水體中生物的生存以及人類安全造成了巨大的影響。目前，我國重金屬及有機污染物污染嚴重，以寧波市為例，寧波市地表水中重金屬Cd、Cr、Pb 含量均超過國家標準。2017年，我國各監(jiān)測點水質(zhì)監(jiān)測的評價結(jié)果顯示：水質(zhì)為優(yōu)良級、良好級、較好級、較差級和極差級的監(jiān)測點分別占8.8%、23.1%、1.5%、51.8%和14.8%。主要超標指標為總硬度、錳、鐵、溶解性總固體、“三氮”（亞硝酸鹽氮、氨氮和硝酸鹽氮）、硫酸鹽、氟化物、氯化物等，個別監(jiān)測點存在砷、六價鉻、鉛和汞等重金屬超標現(xiàn)象。同時，我國在水污染治理過程中還存在水污染治理政策管理機制的缺乏以及水污染治理技術(shù)亟待提高等問題。為改善高污染、高消耗的現(xiàn)狀，實現(xiàn)可持續(xù)經(jīng)濟發(fā)展，我國現(xiàn)今有必要改進污染物毒性的監(jiān)測手段，毒性監(jiān)測技術(shù)逐漸成為一種新興的發(fā)展趨勢。

1.2 傳統(tǒng)的污染物毒性檢測技術(shù)及其優(yōu)缺點

毒性一般分成急性生物毒性和慢性生物毒性。傳統(tǒng)化學方法可以定量檢測水中毒性物質(zhì)含量，但無法檢測有毒物質(zhì)對生物體和環(huán)境的綜合毒性。在衡量毒性對生態(tài)系統(tǒng)的危害時，采用生物可利用性作為指標可以更好地反映其風險影響。然而，傳統(tǒng)水生生物檢測方法（如魚類、原生動物等）雖然可以反映生物影響，但試驗過程冗雜、周期長，不適于急性毒性檢測。

2 基于重組發(fā)光細菌的水質(zhì)毒性檢測

2.1 天然發(fā)光細菌毒性檢測的機理及優(yōu)缺點

天然發(fā)光細菌檢測由于檢測速度快、成本低、敏感度高、發(fā)光強度易觀察等優(yōu)點，被廣泛應用于水質(zhì)急性毒性檢測中。其發(fā)光機理如下：細胞在正常生理狀況下，利用還原型黃素單核苷酸（FMNH2）、長鏈脂肪醛（RCHO）為底物，在氧與細菌熒光素酶的參與下，進行發(fā)光反應（可見光波長420～670 nm），具體如下。

目前，國內(nèi)外應用于水質(zhì)檢測的天然發(fā)光細菌一般為費氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌等，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)了世界上唯一一株無致病性淡水發(fā)光細菌——青?；【?。國際上針對天然發(fā)光細菌的毒性檢測研發(fā)了各類自動在線毒性檢測儀，如Microtox?CTM（Modern Water，英國）和iTOXcontrol?（micro LAN，荷蘭）。但是，目前標準方法（如Microtox?）采用的V.f ischeri和P.phosphoreum都是海洋細菌，每次測定之前都必須進行過濾，并提高鹽度使其在海洋環(huán)境中檢測。而鹽度提高，一些有機物的溶解度降低，導致溶液渾濁。所以，天然發(fā)光細菌毒性檢測方法對于淡水毒性檢測缺乏一定的代表性，對于預測廢水對活性污泥的毒性缺乏準確性，并且無法特異性識別不同種類的污染物。與此同時，不同種類的發(fā)光細菌對不同毒性物質(zhì)的敏感性不同。

2.2 重組發(fā)光細菌優(yōu)勢以及常用發(fā)光基因介紹

由于天然發(fā)光細菌并不能識別水中污染物的具體類別，近年來國內(nèi)外開始構(gòu)建各類可以進行特異性識別污染物的重組發(fā)光細菌。由于大腸桿菌生長速度很快，以大腸桿菌作為宿主細胞、以發(fā)光基因作為報告基因的重組發(fā)光細菌，能夠適應淡水或污水處理廠中的環(huán)境并對不同的毒性物質(zhì)有所響應，由此可進行靈敏、準確、全面的污染物毒性檢測，為進一步分析水質(zhì)安全提供依據(jù)。

重組發(fā)光細菌中常用的報告基因是螢火蟲熒光素酶（luc），細菌熒光素酶（lux）（來源于哈氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌以及費氏弧菌）和綠色熒光蛋白（gfp）（源自Jellyfish Aequorea Victoria）。gfp具有相對高的背景信號，但其熒光強度非線性，定量困難且紫外激發(fā)對GFP 有光漂白和破壞作用，導致熒光快速消失。luc或luxAB需要額外的發(fā)光物質(zhì)，在基于luc和lux的傳感器之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的發(fā)光最大值。盡管luxCDABE較大，但由于自身的方便性和靈敏性，其仍然經(jīng)常被用作報告基因。lux作為生物報告器的首次使用由Enbreghet 完成。1987年，Rogowsky 等人使用無啟動子luxCDABE構(gòu)建了廣譜宿主范圍的pUCD615 載體，廣泛用于重組發(fā)光細菌構(gòu)建中。

2.3 重組發(fā)光細菌類型機制

根據(jù)重組發(fā)光細菌的發(fā)光基因表達機制，人們通常將其分為組成型和誘導型。

組成型通常利用強啟動子，使報告基因（如luxABCDE）在正常條件下高效表達；而在有毒有害條件下，表達水平將降低，其降低水平可測量且與樣本的毒性相關(guān)。因此，組成型表達系統(tǒng)中，任何降低細胞生長速率或?qū)е录毎拘缘奈镔|(zhì)都會導致報告信號強度的降低。然而，該系統(tǒng)只能顯示總毒性結(jié)果，無法檢驗特異性毒性。另外，該系統(tǒng)在某些化合物或誘導物的作用下可能導致應激反應的增加[1]。國際上，對于此類細菌的研究已達30 余年，該類細菌能夠?qū)λw的總毒性進行檢測，其檢測結(jié)果對水質(zhì)安全有著較大意義。迄今已構(gòu)建了很多適用于不同環(huán)境的組成型發(fā)光細菌，雖然其發(fā)光光強較為穩(wěn)定，但其靈敏性仍普遍比天然發(fā)光細菌差，因此還不能代替天然發(fā)光細菌成為標準方法中應用的細菌。

誘導型重組發(fā)光細菌，基于發(fā)光細菌對不同有毒物質(zhì)的敏感性不同。在構(gòu)建重組菌時，將報告基因與降解途徑結(jié)合，即在報告基因上導入特殊應激啟動子（調(diào)控相關(guān)蛋白的基因如recA、fabA、katG等）。由于調(diào)控蛋白的存在，此類重組菌在正常情況下，P/O 區(qū)受到阻遏，發(fā)光基因的表達受到抑制，菌株不發(fā)光或發(fā)光微弱；只有當特殊毒性（既可以是某類毒性損失機制如DNA 損傷、膜損傷和蛋白質(zhì)損傷等，也可以是某種物質(zhì)如重金屬、有機污染物等）存在時，該毒性與對應的調(diào)控蛋白結(jié)合，解除對P/O 的阻遏，發(fā)光基因得到表達，即菌株被該毒性誘導發(fā)光。當該毒性濃度增大時，誘導產(chǎn)生的光強相應增大。但當毒性濃度過大時，其阻礙了細菌的新陳代謝途徑，導致發(fā)光光強減弱。誘導系統(tǒng)提供了組成系統(tǒng)缺乏的特異性，可以定向針對某類或某個污染物進行檢測；但是，由于其特異性，在沒有特異誘導物的情況下，即使存在其他潛在有害或嚴重的化合物，系統(tǒng)也可能沒有反應。由于啟動子的特異性，許多啟動子和報告基因的組合已被用于各種誘導型重組菌。利用傳統(tǒng)方法對啟動子的研究耗時耗力，目前借助計算機輔助DNA 和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，特異性啟動子的篩選效率有望 提高。

3 重組發(fā)光細菌技術(shù)應用研究進展

3.1 重組發(fā)光細菌的構(gòu)建的研究進展

近年來，國內(nèi)（見表1）、國外（見表2、表3）構(gòu)建了各種類型的重組發(fā)光細菌，對應檢測不同的毒性響應機制或者不同的目標污染物。鑒于誘導型重組菌的特異性毒性識別特征，國內(nèi)外所構(gòu)建的大部分為誘導型重組細菌。

國外機構(gòu)的重組發(fā)光細菌的構(gòu)建研究較為全面、完善，構(gòu)建的重組菌可以對化學有機物、重金屬污染物等進行特異性檢測（見表2、表3），部分重組發(fā)光細菌已被制成傳感器，可進行實際的研究操作。韓國的Gwangju Institute of Science and Technology（GIST）機構(gòu)，對誘導型重組發(fā)光細菌的研究構(gòu)建了應激氧化損傷、DNA 損傷、膜損傷和蛋白質(zhì)損傷幾大類的誘導型細菌[2]。由于該發(fā)光細菌可以對毒性性質(zhì)進行區(qū)別，其結(jié)果對指導污水處理廠運行和調(diào)查毒性事件的毒性源有較大的意義。

我國在重組發(fā)光細菌方面的研究起步時間相對國外較晚（見表1），還存在較大的發(fā)展空間。清華大學的何苗課題組對重組發(fā)光細菌的構(gòu)建有深入的研究，主要以luxCDABE為報告基因構(gòu)建各類重組發(fā)光細菌，進行不同毒性響應機制和傳感器的研究。國內(nèi)對于重組發(fā)光細菌的研究還表現(xiàn)在對青?；【陌l(fā)光基因的探索上[3]。

表1 國內(nèi)重組發(fā)光細菌的研究現(xiàn)狀

表2 國外重組發(fā)光細菌的研究現(xiàn)狀（化學有機物）

表3 國外重組發(fā)光細菌的研究現(xiàn)狀（金屬）

3.2 基于重組發(fā)光細菌的傳感器的研究進展

基于天然發(fā)光細菌和重組發(fā)光細菌的一致熒光信號，兩者可用相同的熒光探頭采集信號，均可在同一套儀器檢測系統(tǒng)中使用。天然發(fā)光細菌毒性檢測方法反映了水體的急性綜合毒性，目前已經(jīng)能成功檢測重金屬等無機污染物和各類化學有機污染物。

雖然對于發(fā)光細菌毒性檢測的研究已經(jīng)有了很多的成果，通過構(gòu)建新種類的細菌也使得該方法，能在更廣泛的環(huán)境下進行檢測，同時能檢測出更多種類的毒性物質(zhì),但是標準方法中應用的檢測方法不能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)檢測，同時也不能進行實驗現(xiàn)場檢測。因此，將生物敏感元件與信號傳導器相結(jié)合，形成了生物傳感器，其特有的使用簡單、快速響應和在線監(jiān)測的適應性讓其有更大的發(fā)展前景。天然發(fā)光細菌以及重組發(fā)光細菌均能在實驗室里獲得良好的檢驗結(jié)果，然而直接在野外檢測時使用報告菌株會受到許多限制。因此，利用生物芯片技術(shù)可以通過生物、化學、光學等方法，整合生物感應原件和信號的生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化過程，應用于芯片中，便于攜帶。同時，將報告菌株固定于特定材料上，這樣既可以保持其活性，又可以轉(zhuǎn)換放大各類信號，使得后續(xù)操作更加簡便[4]。目前，國內(nèi)一些研究中將發(fā)光細菌固定于混合纖維膜上，或者包埋于海藻酸鈉凝膠中，與硅光片相接從而輸出電信號。

為了能夠準確檢測實際水樣的毒性，目前發(fā)光細菌傳感器的研究主要集中在以下兩個方面：現(xiàn)場在線連續(xù)檢測、便攜式系統(tǒng)。在這兩個方面研究中，同時都注意了利用多種發(fā)光細菌進行檢測，這樣能夠得到更全面和準確的結(jié)果。

3.2.1 在線自動檢測

水體生物毒性的實時監(jiān)控對于水質(zhì)監(jiān)控和廢水處理非常重要，因此具有自動化和遠程實時監(jiān)控優(yōu)勢的在線毒性檢測得到了廣泛重視和研究。在線毒性檢測可以在固定地點，自動地提供連續(xù)的水體毒性數(shù)據(jù)，作為水體毒性監(jiān)控的工具有很大的潛力。

目前，人們已經(jīng)研發(fā)出將發(fā)光細菌固定在瓊脂糖或者經(jīng)冷凍干燥后將其固定在微孔板上的毒性監(jiān)測儀，然而這樣的監(jiān)測儀存在許多弊端。由于許多具有不同化學結(jié)構(gòu)的化合物可能具有相同的生物毒性作用，精確度低，易產(chǎn)生試驗誤差。此外，所有這些技術(shù)都需要操作熟練的技術(shù)人員和昂貴的設(shè)備；設(shè)備運行復雜并且結(jié)果可能需要數(shù)天才能獲得。因此，近年來，國內(nèi)外開發(fā)了一些具有實時檢測能力的操作簡單、成本低廉的便攜式在線監(jiān)測系統(tǒng)。

Evgeni Eltzov 等研究調(diào)整了幾種影響傳感器性能的工程參數(shù)，設(shè)計的含纖維測量單元的結(jié)構(gòu)降低了剪切應力，從而防止其降解[5]。因此，這種系統(tǒng)允許在更短的時間內(nèi)測試更大體積的樣品的更高流速，從而提高測量的持續(xù)時間，并增加了靈敏度。

汪用志等研發(fā)了基于重組發(fā)光細菌的重金屬生物毒性自動在線監(jiān)測儀，儀器系統(tǒng)可以自動穩(wěn)定運行3d[6]。在此基礎(chǔ)上，又設(shè)計開發(fā)了二維生物毒性自動在線監(jiān)測儀，同時使用天然發(fā)光細菌中的費氏弧菌Vibrio f ischeri和對重金屬汞有特異性響應的重組發(fā)光細菌pTHE30-E.Coli進行水質(zhì)測定，聯(lián)合檢測水樣的重金屬生物毒性和水質(zhì)急性綜合毒性。

3.2.2 便攜式系統(tǒng)

除了在線監(jiān)測水體毒性之外，為了能夠進行野外現(xiàn)場隨機分布采樣點的即時檢測和大批量樣品的檢測，人們研制了一些微型化集成檢測系統(tǒng)，使得傳感器結(jié)構(gòu)更加緊湊和小巧。一個便攜式的發(fā)光細菌傳感器必須滿足以下幾個要求：傳感細菌必須在儲存和運輸?shù)浆F(xiàn)場的過程中不喪失活性；該系統(tǒng)檢測必須具有較短的檢測時間；在檢測結(jié)構(gòu)中對毒性響應產(chǎn)生的生物發(fā)光與環(huán)境中的光之間的互相影響必須最小化；對于缺少預處理的真實樣品檢測，這個便攜式傳感器的操作必須簡單。

于海等研究優(yōu)化了一種監(jiān)測水中污染物急性毒性的生物傳感器，該傳感器采用固定了明亮發(fā)光桿菌的光纖探頭[7]。優(yōu)化后的傳感器檢測了Zn2+、NH3+、硝基苯和甲酚等4 種水中典型污染物的劑量-效應曲線，并通過計算確定了其EC50。該傳感器經(jīng)過比較試驗后證明其與標準法具有良好相關(guān)性，能反映水中污染物的總毒性。

Evgeni Eltzov 等研制并優(yōu)化了一種新型的液體光波導細菌生物傳感器，用于測定水中有毒污染物的存在。該系統(tǒng)主要由以下幾個部分組成：一個非一次性的液體光波導、PMT 探頭和固定在在海藻酸鈣片基質(zhì)中的發(fā)光細菌。該傳感器可以在非常低的樣本容量下對水化學物質(zhì)進行敏感和便攜的量化，可以針對世界欠發(fā)達地區(qū)進行水質(zhì)分析[8]。

3.3 檢測條件優(yōu)化（假陰性問題）的研究進展

細胞的培養(yǎng)過程中，由于細胞暴露于致命濃度的有毒化合物下，營養(yǎng)物質(zhì)的不均勻分布，或抑制性化合物的存在等情況下，細胞可能喪失活性而死亡。此時無法檢測到信號，致使結(jié)果出現(xiàn)誤差，生物發(fā)光測試可能導致假陰性。目前，已經(jīng)提出了幾種抵消這個問題的方法。例如，在組成型表達生物傳感器中，基線水平表達的下降即可表明生物轉(zhuǎn)運蛋白被抑制或失活。

汪用志等嘗試應用內(nèi)標法來避免誤報問題，研究發(fā)現(xiàn)，在實際水樣測試中，使用額外目標物質(zhì)的平行測試適用于估計水樣的細胞毒性并且能夠避免假陰性干擾[6]。該研究中的重組發(fā)光菌株可用于靈敏、特異地測定水樣中Hg2+的生物利用度。干擾物質(zhì)如鎘的影響有限，誤報問題得到控制。為了避免假陰性問題，在帶有額外汞的平行測試中使用內(nèi)標法，其不僅容易操作，而且有助于識別假陰性樣本。

4 基于重組發(fā)光細菌毒性監(jiān)測的發(fā)展趨勢

為完善重組發(fā)光細菌的毒性監(jiān)測方法，提高數(shù)據(jù)的準確度，近年來出現(xiàn)了各類改進方法。針對目前發(fā)光細菌急性毒性標準測試方法中存在的準確度問題，通過優(yōu)化改良實驗條件以及操作步驟，增加發(fā)光自然變化因子和原始發(fā)光光強2 個參數(shù)，減少了穩(wěn)定性誤差與手工加樣誤差。以Fabonacci 法進一步優(yōu)化改進基于Windows 和Android 平臺開發(fā)的曲線擬合模型的各項系數(shù)，編寫了毒性物質(zhì)成分和濃度預測的遠程在線水質(zhì)生物毒性預測軟件[9]。算法對磁力攪拌時間、培養(yǎng)溫度、暴露時間及pH 值范圍對EC50 測定值的影響進行分析，加強了精確度和穩(wěn)定性。

目前，重組發(fā)光細菌的在線監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展趨勢主要有：構(gòu)建針對不同污染物或污染機制的特異性重組發(fā)光細菌；提高重組菌的靈敏度、穩(wěn)定性，避免假陰性；優(yōu)化傳感器性能；對不同類別、性質(zhì)水域水體進行在線檢測儀器的功能優(yōu)化；提高數(shù)據(jù)精確度和可信度。

5 結(jié)論

隨著水中有毒物質(zhì)的毒性危害逐漸被人們所認識，水中毒性的檢測也越來越被人們所重視。但是，標準的發(fā)光細菌檢測方法不能滿足特異性的在線檢測、現(xiàn)場檢測等要求。重組發(fā)光細菌毒性檢測具有非常好的應用前景，其能夠適應不同的檢測環(huán)境，并且能夠檢測多種物質(zhì)或多種類型的毒性。隨著傳感器的研制，其操作更加迅速和簡便，可能大范圍推廣。但目前其檢測結(jié)果的靈敏性略遜于標準方法，準確性也有待進一步提高。我國對重組發(fā)光細菌毒性檢測的研究起步較晚，更需要盡快彌補此方向的空白，使其有望成為可以廣泛應用的標準方法。