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    兔VX2肝癌經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞術(shù)后癌旁肝組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡

    2019-02-20 09:13:00,,,
    關(guān)鍵詞:供血肝功能氧化應(yīng)激

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    (大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科,云南 大理 671000)

    原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)是常見(jiàn)惡性腫瘤之一。我國(guó)肝癌發(fā)病率逐年上升[1],且多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)切除或肝移植治療機(jī)會(huì)[2]。近年來(lái),經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞(transcatheter arterial embolization, TAE)已逐漸成為治療PHC的首選方法[3-4],其腫瘤局部控制率較高,但術(shù)后患者出現(xiàn)不同程度肝功能下降,影響生存質(zhì)量[5]。本研究建立兔VX2肝癌模型,觀察TAE術(shù)后癌旁肝組織氧化應(yīng)激及凋亡情況,旨在分析TAE術(shù)后氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡在癌旁肝組織損傷中的作用,為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 兔VX2肝癌模型建立 選取健康新西蘭大白兔37只(由大理大學(xué)動(dòng)物中心提供),雌雄不限,體質(zhì)量2.50~3.50 kg,平均(2.85±0.25)kg;荷瘤兔2只(由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院惠贈(zèng))。采用改良CT定位下瘤塊注射法[6],對(duì)37只新西蘭大白兔建立VX2肝癌模型,2周后經(jīng)CT和/或MR檢查證實(shí)25只建模成功(圖1)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)P头纸M及處理 將兔VX2肝癌模型隨機(jī)分為T(mén)AE組(n=13)及對(duì)照組(n=12)。采用GE Innova-3100IQ DSA引導(dǎo),對(duì)TAE組行肝動(dòng)脈罌粟乙碘油注射液及明膠海綿顆粒栓塞。采用3%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)兔后,將其保定于自制實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上,對(duì)右側(cè)腹股溝附近10 cm范圍內(nèi)備皮、消毒后做一切口,以18G穿刺針穿刺右股動(dòng)脈后引入4F導(dǎo)管鞘及導(dǎo)管,通過(guò)導(dǎo)絲選擇至腹腔干,以同軸技術(shù)將TERUMO微導(dǎo)管(泰爾茂公司)超選擇至肝總動(dòng)脈,造影明確腫瘤供血?jiǎng)用}后,經(jīng)微導(dǎo)管注射罌粟乙碘油(圖2A),常規(guī)劑量(ml)=腫瘤直徑(cm)×0.2,依據(jù)個(gè)體腫瘤供血情況適當(dāng)增減[7];之后以明膠海綿顆粒進(jìn)行栓塞,直至供血?jiǎng)用}血流緩慢停止(圖2B)。術(shù)畢拔管并結(jié)扎肝動(dòng)脈近端,處理切口。常規(guī)飼養(yǎng)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔,對(duì)其不進(jìn)行任何處理。

    1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 分組處理后3天,對(duì)2組實(shí)驗(yàn)兔均經(jīng)耳緣靜脈抽血并行實(shí)驗(yàn)室檢查,以評(píng)價(jià)其肝功能,包括:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin time, TBI)、血清白蛋白(serum albumin, ALB)及凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)。

    1.4 離體標(biāo)本處理 完成實(shí)驗(yàn)室檢查后處死實(shí)驗(yàn)兔,并于其左上腹劍突下行腹正中切口,完整取出肝臟,分離腫瘤組織與癌旁肝組織(距腫瘤>2 cm)[8],作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

    1.5 組織病理檢查 對(duì)2組腫瘤組織及癌旁肝組織標(biāo)本均進(jìn)行固定及石蠟包埋、切片(厚度3~4 μm)及HE染色,采用Olympus BX41光學(xué)顯微鏡行組織病理學(xué)檢查。

    1.6 生物酶學(xué)檢測(cè) 分別采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司),對(duì)2組癌旁肝組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

    1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),對(duì)2組癌旁肝組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),以TUNEL法評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞核內(nèi)著色呈褐色(包括深、淺褐色)或棕黃色即為凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)計(jì)算:在高倍光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)記數(shù)10個(gè)視野,分別計(jì)算該視野內(nèi)凋亡細(xì)胞所占百分比,取平均值作為AI。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示,2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肝功能指標(biāo)變化 與對(duì)照組比較,TAE組ALT、AST、TBI升高,ALB降低,PT延長(zhǎng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001),見(jiàn)表1。

    2.2 病理改變 組織病理學(xué)檢查顯示,2組兔VX2肝癌模型腫瘤組織細(xì)胞均呈條索狀、巢狀或呈腺管樣排列,核大,癌巢周?chē)梢?jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞包繞;TAE組癌旁肝組織輕度脂肪變性,同時(shí)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主(圖3A);對(duì)照組癌旁肝組織僅見(jiàn)輕度脂肪變性(圖3B)。

    表1 TAE術(shù)后各組肝功能指標(biāo)測(cè)定值(±s)

    表1 TAE術(shù)后各組肝功能指標(biāo)測(cè)定值(±s)

    組別ALT(U/L)AST(U/L)TBI(μmol/L)ALB(g/L)PT(s)TAE組(n=13)83.89±16.33117.37±18.7620.60±1.8333.53±1.3515.68±0.96對(duì)照組(n=12)53.07±7.6376.37±13.2914.75±1.6036.45±1.1013.51±0.73t值-6.118-6.530-7.9305.936-6.318P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

    表2 各組癌旁肝組織SOD、GSH-PX和 CAT的測(cè)定值(U/mgprot,±s)

    表2 各組癌旁肝組織SOD、GSH-PX和 CAT的測(cè)定值(U/mgprot,±s)

    組別SODCATGSH-PXTAE組(n=13)21.81±1.341.15±0.14187.68±4.83對(duì)照組(n=12)45.48±1.643.09±0.34262.62±4.45t值39.69318.24140.221P值<0.001<0.001<0.001

    圖1 兔VX2肝癌模型CT表現(xiàn) A.CT平掃示肝實(shí)質(zhì)內(nèi)不均勻低密度病灶,腫瘤中心密度較低(箭); B.CT增強(qiáng)掃描可見(jiàn)腫瘤邊緣呈不均勻明顯強(qiáng)化,中心壞死區(qū)無(wú)強(qiáng)化(箭) 圖2 兔VX2肝癌模型TAE術(shù)中DSA表現(xiàn) A.腹腔干造影示腫瘤血管推移呈“抱球征”(箭); B.超選擇性插管至腫瘤供血?jiǎng)用}后推注罌粟乙碘油,可見(jiàn)腫瘤區(qū)碘油沉積(箭)

    2.3 癌旁肝組織生物酶活性 生物酶學(xué)檢測(cè)顯示,TAE組SOD、GSH-PX、CAT均低于對(duì)照組(P均<0.001),見(jiàn)表2。

    2.4 癌旁肝組織中細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色結(jié)果顯示,TAE組癌旁肝組織中細(xì)胞凋亡明顯(圖4)。TAE組及對(duì)照組AI分別為(64.20±2.77)%和(2.20±1.90)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-112.30,P<0.001)。

    3 討論

    人體肝臟接受肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈雙重血供,肝動(dòng)脈血流阻塞時(shí),門(mén)靜脈可代償供血,以維持肝臟正常功能。肝動(dòng)脈可提供99%左右的肝腫瘤供血,為T(mén)AE治療PHC提供了理論支持[9]。目前TAE已成為無(wú)法外科手術(shù)切除的中晚期肝癌的有效治療方法,但由于肝血竇及肝內(nèi)側(cè)支循環(huán)豐富,TAE治療時(shí)栓塞劑不可避免地進(jìn)入腫瘤周?chē)8谓M織并沉積于微小動(dòng)脈和毛細(xì)血管內(nèi),導(dǎo)致組織缺血、缺氧,從而使肝組織內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧,引發(fā)一系列復(fù)雜的內(nèi)源性反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、凋亡[10],即使采用超選擇性栓塞仍不能避免TAE術(shù)后肝功能下降。此外,過(guò)多的自由基會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致組織損傷。SOD、GSH-PX、CAT是生物體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的天然自由基清除系統(tǒng)[11],屬于酶促抗氧化系統(tǒng),一方面可阻斷體內(nèi)脂質(zhì)的過(guò)氧化進(jìn)程,另一方面將有害的脂質(zhì)過(guò)氧化物還原成無(wú)害羥基化合物。SOD、GSH-PX、CAT均可反映生物體去除氧自由基的能力,其中SOD最為關(guān)鍵[12]。肝臟血流被阻斷并再重新恢復(fù)供應(yīng)后,產(chǎn)生大量活性氧,具有較活躍的化學(xué)性質(zhì),極易與肝細(xì)胞膜上的重要功能與結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),從而引起肝細(xì)胞損傷和凋亡[13]。研究[14]報(bào)道,SOD等能夠及時(shí)清除組織和細(xì)胞內(nèi)的活性氧,保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化損傷。本研究建立兔VX2肝癌模型,探討TAE術(shù)后癌旁肝組織中氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡在癌旁肝組織損傷中的作用,結(jié)果顯示TAE組癌旁肝組織中SOD、GSH-PX、CAT活性較對(duì)照組均明顯下降,提示TAE術(shù)后癌旁肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激,破壞了肝細(xì)胞正常的生理功能。

    圖3 兔VX2肝癌模型離體腫瘤組織標(biāo)本病理圖(HE,×40) A.TAE組; B.對(duì)照組 圖4 兔VX2肝癌模型離體癌旁肝組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法,×40) A.TAE組; B.對(duì)照組

    細(xì)胞凋亡是機(jī)體在發(fā)育過(guò)程中或某些因素作用下,通過(guò)一系列復(fù)雜調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡。組織缺血、缺氧,產(chǎn)生大量氧自由基及腫瘤浸潤(rùn)等病理因素均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中的TUNEL染色結(jié)果顯示,TAE組癌旁肝組織AI明顯高于對(duì)照組,提示細(xì)胞凋亡與TAE術(shù)后肝損傷有關(guān),與既往研究[15]結(jié)果相符。

    由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較小,加之檢測(cè)方法的局限性及研究因素不夠全面,對(duì)TAE術(shù)后癌旁肝組織損傷的機(jī)制研究不夠深入和透徹,將在今后的研究中進(jìn)一步分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫印跡、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和基因敲除等方法對(duì)TAE術(shù)后肝功能的影響。

    綜上所述,TAE術(shù)后,兔VX2肝癌模型肝細(xì)胞缺血、缺氧,癌旁肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激,且癌旁肝組織中SOD、CAT、GSH-PX活性下降而產(chǎn)生的大量氧自由基使肝細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加劇,最終導(dǎo)致肝功能下降。本實(shí)驗(yàn)從活體動(dòng)物水平觀察氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡在肝組織損傷中的作用,有利于臨床探尋能夠安全、有效地減輕TAE術(shù)后肝損傷的方法。將SOD等抗氧化酶作為保護(hù)肝功能的靶點(diǎn),通過(guò)激活酶促抗氧化系統(tǒng)清除過(guò)多的氧自由基,從而減輕TAE術(shù)后對(duì)肝功能的損害,有望成為今后臨床研究的方向之一。

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