血漿種類和溫度對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲非寄生變態(tài)發(fā)育及早期稚蚌生長(zhǎng)的影響

馬學(xué)艷，聞海波，金 武，華 丹，徐 跑,3，顧若波,3

（1中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081；2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081）

0 引言

在自然界，絕大多數(shù)的蚌類需要寄生到寄主上（主要是魚）才能完成變態(tài)發(fā)育[1-2]。有的蚌有多種寄主魚，如Anodonta anatina[3]，有的蚌只能寄生一種魚，如Alasmidonta mino[4]。體外培養(yǎng)是不經(jīng)過魚體寄生過程使鉤介幼蟲變態(tài)成為稚蚌的技術(shù)。目前，已知宿主魚信息的淡水蚌類僅占1/4[5]，體外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)蚌類繁育保護(hù)，尤其對(duì)寄主魚瀕危和未知淡水蚌類的人工繁殖具有重要作用。

利用體外培養(yǎng)技術(shù)已成功培養(yǎng)41個(gè)蚌類，其中有18種可以利用動(dòng)物血清完成變態(tài)發(fā)育[5]。Isom等[6-7]最早創(chuàng)建了鉤介幼蟲體外培養(yǎng)技術(shù)，通過添加魚血清，首次成功獲得了幾種非寄生變態(tài)發(fā)育的稚蚌，證明血清是蚌科鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)。Uthaiwan等[8]測(cè)試了4種魚和馬血清對(duì)Hyriopsis myersiana鉤介幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，表明血清種類對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率及稚蚌早期成活率影響顯著。馬學(xué)艷[9]比較了寄主魚與非寄主魚血漿對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的影響，結(jié)果表明非寄主魚血清對(duì)鉤介幼蟲的變態(tài)發(fā)育及變態(tài)稚蚌的生長(zhǎng)無顯著影響。而動(dòng)物血清是否能代替魚血清在體外培養(yǎng)技術(shù)中為褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)因子有待于進(jìn)一步研究。

蚌類按繁殖類型可以分為兩類[4]：第一類為長(zhǎng)期發(fā)育類型，多秋季交配，寄生繁育期水溫較低，如褶紋冠蚌(C.plicata)[10]、絹絲麗蚌(Lamprotula fibrosa)[11]；第二類為短期孵育類型，多在春末和夏季排放幼蟲，寄生繁育期水溫較高，如三角帆蚌(H.cumingii)[12]。不同繁育類型的蚌類幼蟲變態(tài)發(fā)育的溫度存在較大差異。而在經(jīng)典的體外培養(yǎng)技術(shù)中，培養(yǎng)溫度一般設(shè)定為23～25℃[8,13-15]。Roberts和Barnhart[16]測(cè)試了溫度對(duì)淡水蚌A.suborbiculat鉤介幼蟲的變態(tài)發(fā)育影響，證實(shí)溫度影響其變態(tài)率。體外培養(yǎng)溫度對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)率是否有影響有待評(píng)估。

褶紋冠蚌隸屬蚌科(Unionidae)、無齒蚌亞科(Anodontinae)，為大型雙殼類，生長(zhǎng)快，凈水能力強(qiáng)，是中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)之一，也是湖泊增殖放流的主要淡水蚌類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。本研究比較3個(gè)培養(yǎng)溫度對(duì)鉤介幼蟲的變態(tài)發(fā)育影響，對(duì)其生物學(xué)零度和有效積溫進(jìn)行了估算，同時(shí)測(cè)試了特定寄主魚—鳙魚(Aristichthys nobilis)血漿及2種商用動(dòng)物血清對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率的影響；進(jìn)一步比較了養(yǎng)殖水溫對(duì)變態(tài)稚蚌早期成活和生長(zhǎng)影響。本研究結(jié)果將進(jìn)一步完善淡水蚌類鉤介幼蟲體外培養(yǎng)技術(shù)和理論，為淡水蚌類的增值保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 褶紋冠蚌親本采集及成熟鉤介幼蟲獲得 試驗(yàn)用褶紋冠蚌采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地，為4～5齡性成熟母蚌；從10月中旬開始（水溫低于21℃），檢查雌蚌外鰓絲是否有成熟鉤介幼蟲。選取含有成熟鉤介幼蟲的母蚌，在室溫(24±0.5)℃條件下干燥24 h，便于鉤介幼蟲的排出。鉤介幼蟲的成熟判斷標(biāo)準(zhǔn)及獲得方法參照聞海波等[12]方法，鉤介幼蟲的清洗參考Uthaiwan等[13]方法，清洗幼蟲水溫為24±0.5℃。

1.1.2 血清準(zhǔn)備 選取體格健壯、外表無傷的鳙魚作為血清采集實(shí)驗(yàn)魚，其體重為(163±17)g。采血前，試驗(yàn)魚用50～100 mg/L的MS-222（生工生物工程（上海）股份有限公司）麻醉，注射器用2800單位/mL的肝素鈉潤(rùn)洗，采血方法參考Uthaiwan等[13]方法，血液采集后3000 r/min離心10 min，取上清液；用0.22 μm無菌過濾器過濾，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。特?jí)馬血清(E510006)、特級(jí)胎牛血清(E600001)購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 血清對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿、馬血清、胎牛血清作為鉤介幼蟲體外培養(yǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)源，以L-15為基礎(chǔ)培養(yǎng)液（生工生物工程（上海）股份有限公司），基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清、抗生素混合液比例為2:1:0.5，培養(yǎng)液及幼蟲置于無菌培養(yǎng)皿(15×60 mm)中，每盒幼蟲數(shù)量300±10只。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），每3天換液一次，共換液3次。抗生素混合液配方：100 μg/mL羧芐青霉素二鈉、100 μg/mL硫酸慶大霉素、100 μg/mL發(fā)霉素和5 μg/mL兩性霉素B。鉤介幼蟲變態(tài)標(biāo)準(zhǔn)參照Uthaiwan等[13]標(biāo)準(zhǔn)，鉤介幼蟲變態(tài)率計(jì)算見公式(1)。

1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率的影響

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿作為鉤介幼蟲體外培養(yǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)源，設(shè)置18、24、30℃3個(gè)培養(yǎng)溫度，為降低鉤介幼蟲的應(yīng)激反應(yīng)，18℃組每天降低2℃，30℃組每天升高2℃，2個(gè)溫度組在第3天達(dá)到設(shè)定溫度。3種溫度條件下培養(yǎng)的鉤介幼蟲均換液3次，其中18℃培養(yǎng)條件下5天換1次，24℃培養(yǎng)條件下3天換1次，30℃條件下2天換1次。其他條件同1.2描述。

1.4 變態(tài)發(fā)育生物學(xué)零度和有效積溫的計(jì)算

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿作為鉤介幼蟲體外培養(yǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)源，培養(yǎng)鉤介幼蟲3組，每組5個(gè)重復(fù)，分別放在18、24、30℃下培養(yǎng)，通過預(yù)試驗(yàn)可知三組溫度條件分別從培養(yǎng)第8、5、3天開始統(tǒng)計(jì)幼蟲變態(tài)率；正常變態(tài)發(fā)育的鉤介幼蟲，在未完成變態(tài)前均為閉合狀，開口狀幼蟲均不能變態(tài)發(fā)育成稚蚌。統(tǒng)計(jì)時(shí)，在無菌操作臺(tái)中每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)吸取30只，單獨(dú)放在培養(yǎng)皿中加入曝氣自來水，進(jìn)行喚醒。統(tǒng)計(jì)閉合鉤介幼蟲的數(shù)量，若閉合鉤介幼蟲經(jīng)喚醒后變態(tài)率＞95%，則視為在此溫度下鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育完成。

根據(jù)直線回歸方法，運(yùn)用公式(2)[17-18]計(jì)算有效積溫(K)，公式(3)計(jì)算鉤介幼蟲培養(yǎng)溫度。

其中，N為鉤介幼蟲培養(yǎng)時(shí)間(d)；T為鉤介幼蟲培養(yǎng)溫度(℃)。

1.5 不同血漿組變態(tài)稚蚌的成活與生長(zhǎng)評(píng)估

取3種血清（血漿）培養(yǎng)的變態(tài)成功稚蚌各500只，每組100只，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，分別放在塑料箱子(32×21×10 cm)中培育，加熱棒控溫，養(yǎng)殖溫度為24℃，養(yǎng)殖水體為5 L。用充分曝氣自來水養(yǎng)殖，每天添加少量底泥，其中底泥為未施肥的花園土，加入水后過200目篩網(wǎng)，微波爐高溫處理10 min，冷卻后使用。投喂?jié)饪s藻類[19]，使水體藻密度保持在2×106個(gè)/mL，每天換水1/2，換水時(shí)用200目篩網(wǎng)過濾，確保稚蚌不丟失。培育30天后在光學(xué)顯微鏡(Olympus CX41)下拍照、測(cè)量幼蚌殼長(zhǎng)(0.01 mm)，并統(tǒng)計(jì)成活率。

1.6 養(yǎng)殖水溫對(duì)早期稚蚌生長(zhǎng)的影響

取以鳙魚血漿作為營(yíng)養(yǎng)源在30、24℃培養(yǎng)的變態(tài)成功稚蚌各500只，18℃培養(yǎng)的稚蚌1500只，養(yǎng)殖條件見表1（養(yǎng)殖時(shí)若有溫差，每天升高2℃），其他條件同實(shí)驗(yàn)1.5中描述。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用OnewayANOVA單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD法）。在Excel 2010繪制相關(guān)圖表。

表1 鉤介幼蟲培養(yǎng)條件及稚蚌養(yǎng)殖條件

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響

血漿對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響如圖1所示，單因素方差分析表明：鳙魚血漿培養(yǎng)的鉤介幼蟲變態(tài)率極顯著高于馬血清、牛血清組(P＜0.01)，牛血清組變態(tài)率極顯著高于馬血清組(P＜0.01)。

字母不同表示差異顯著(P＜0.05)

2.2 溫度對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響

溫度對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響如圖2所示，單因素方差分析表明：18℃培養(yǎng)的鉤介幼蟲變態(tài)率均顯著高于30、24℃(P＜0.05)；30℃培養(yǎng)的鉤介幼蟲變態(tài)率最低，顯著低于24℃組(P＜0.05)。

2.3 褶紋冠蚌生物學(xué)零度和有效積溫

褶紋冠蚌鉤介幼蟲在30、24、18℃條件下，完成變態(tài)發(fā)育時(shí)間分別是5、7、12天，根據(jù)T=(1/N)*K+C可得：褶紋冠蚌生物學(xué)零度為9.34℃，有效積溫為102.84℃·d。

2.4 不同血清培養(yǎng)對(duì)早期稚蚌生長(zhǎng)發(fā)育的影響

不同血清培養(yǎng)對(duì)早期稚蚌生長(zhǎng)發(fā)育的影響如表2所示，鳙魚血漿培養(yǎng)成功的稚蚌成活率顯著高于牛血清組(P＜0.05)，極顯著高于馬血清組(P＜0.01)，早期稚蚌養(yǎng)殖一個(gè)月后，鳙魚血漿組稚蚌殼長(zhǎng)顯著高于牛血清組、馬血清組組(P＜0.05)，牛血清組與馬血清組之間稚蚌殼長(zhǎng)無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 溫度對(duì)鉤介幼蟲體外培養(yǎng)變態(tài)率影響

圖3 褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的有效積溫及生物學(xué)零度

表2 不同血漿培養(yǎng)對(duì)早期稚蚌生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.5 養(yǎng)殖溫度對(duì)早期稚蚌生長(zhǎng)發(fā)育的影響

A1、A2、A3 為在 30、24、18℃中培養(yǎng)，在 30、24、18℃條件下養(yǎng)殖的稚蚌，單因素方差表明，A3組、A2組成活率極顯著高于A1組(P＜0.01)，且A3組顯著高于A2組(P＜0.05)；A1、A2組稚蚌殼長(zhǎng)無顯著性差異P＞0.05)，顯著高于A3組(P＜0.05)。

A3、A4、A5組為18℃條件培養(yǎng)成功變態(tài)，在不同溫度養(yǎng)殖的早期稚蚌，A3組成活率顯著高于A4組(P＜0.05)，極顯著高于A5組(P＜0.01)，A4、A5組稚蚌殼長(zhǎng)無顯著性差異(P＞0.05)，顯著高于A3組(P＜0.05)。

表3 培養(yǎng)溫度對(duì)稚蚌早期的生長(zhǎng)發(fā)育的影響

3 討論

3.1 血清對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率及早期稚蚌生長(zhǎng)的影響

3.1.1 血清對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率的影響 Isom和Hudson[7]研究表明，魚血清種類對(duì)蚌的培養(yǎng)是沒有影響的。Owen[20]用兔血清和鯉魚血清培養(yǎng)Lampsilis fasciola變態(tài)率無顯著性差異，對(duì)Utterbackia imbecillis培養(yǎng)時(shí)，兔血清和鯉魚血清變態(tài)率顯著高于用胎牛血清培養(yǎng)的鉤介幼蟲組，兔血清和鯉魚血清組無顯著性差異。Uthaiwan等[13]用H.myersiana測(cè)試了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)血清和馬血清體外培養(yǎng)的效果，證實(shí)魚血清組變態(tài)率顯著高于馬血清，用4種魚血清和馬血清在對(duì)H.myersiana鉤介幼蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)，用鯉魚(Cyprinus carpio)血清培養(yǎng)的鉤介幼蟲成活率及變態(tài)率顯著高于用其他4種血清，以紋鯰魚(Pangasius pangasius)為營(yíng)養(yǎng)源組變態(tài)率最低[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用魚類血清培養(yǎng)的褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)率顯著高于動(dòng)物血清培養(yǎng)，這可能是不同蚌類對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求不同導(dǎo)致。

3.1.2 血清培養(yǎng)對(duì)早期稚蚌成活的影響 Uthaiwan等[8]用4種魚血清和馬血清在對(duì)H.myersiana鉤介幼蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)，只有鯉魚血清培養(yǎng)的稚蚌可以存活2個(gè)月以上，而尼羅羅非魚(O.niloticus)和雜交鯰魚(Clarias macrocephalus×C.garienus)血清培養(yǎng)鉤介幼蟲只存活1個(gè)月，馬血清培養(yǎng)的鉤介幼蟲只存活2～3個(gè)星期，條紋鯰魚(P.pangasius)血清培養(yǎng)的稚蚌只存活了1個(gè)星期。Reece[21]比較了魚體寄生和利用馬血清體外培養(yǎng)2種方法獲得L.fasciola稚蚌后期生長(zhǎng)及存活差異，結(jié)果顯示：魚體寄生變態(tài)稚蚌生長(zhǎng)比體外培養(yǎng)快，1周后魚體寄生稚蚌的成活率為82%，用馬血清作為營(yíng)養(yǎng)源的體外培養(yǎng)成功的稚蚌成活率僅為45%。本試驗(yàn)中用3種血清培養(yǎng)的變態(tài)稚蚌在28天均有成活，用寄主魚血清培養(yǎng)的鉤介幼蟲成活率顯著高于馬血清、牛血清組，且稚蚌生長(zhǎng)較快，表明添加寄主魚血清的培養(yǎng)配方最適宜褶紋冠蚌鉤介幼蟲生長(zhǎng)。

3.2 溫度對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率及早期稚蚌成活的影響

3.2.1 溫度對(duì)鉤介幼蟲變態(tài)率的影響 Roberts和Barnhart[16]研究A.suborbiculat證實(shí)在寄生實(shí)驗(yàn)中，鉤介幼蟲在10、15℃變態(tài)率顯著高于20℃，體外培養(yǎng)試驗(yàn)中鉤介幼蟲在20、15℃時(shí)變態(tài)率顯著高于10℃。本試驗(yàn)最低溫度與Roberts和Barnhart[16]的最高溫度相近，都產(chǎn)生了較高的變態(tài)率，可能是A.suborbiculat和褶紋冠蚌同屬于長(zhǎng)期發(fā)育類型，寄生繁育水溫較低，推測(cè)長(zhǎng)期發(fā)育類型的蚌科鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育隨溫度變化可能呈現(xiàn)拋物線趨勢(shì)，還需后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

3.2.2 溫度對(duì)早期稚蚌成活的影響 培養(yǎng)溫度分別為18、30℃、同在30℃養(yǎng)殖的早期稚蚌成活率不同，稚蚌殼長(zhǎng)無顯著性差異，表明30℃培養(yǎng)的稚蚌雖能變態(tài)發(fā)育，但稚蚌發(fā)育不完全，影響后期成活。培養(yǎng)溫度分別為18、24℃、同在24℃養(yǎng)殖的稚蚌成活率和殼長(zhǎng)無顯著性差異，表明24℃條件培養(yǎng)的鉤介幼蟲發(fā)育正常。18℃條件下培養(yǎng)的稚蚌，在不同溫度下養(yǎng)殖，溫度越低，成活率越高，這可能是褶紋冠蚌為秋末春初繁殖，溫度較低，鉤介幼蟲及稚蚌更加適應(yīng)在低溫下發(fā)育生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與褶紋冠蚌的繁殖習(xí)性相符。

3.3 蚌類變態(tài)發(fā)育生物學(xué)零度和有效積溫的測(cè)試方法

關(guān)于三角帆蚌[22]、橢圓背角無齒蚌[23]、背瘤麗蚌[24]等鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育的生物學(xué)零度和有效積溫都有報(bào)道，研究者均采用魚體寄生方法來測(cè)定，而鉤介幼蟲的寄生變態(tài)發(fā)育時(shí)間主要受到養(yǎng)殖水溫、寄主魚營(yíng)養(yǎng)、寄生部位及鉤介幼蟲質(zhì)量等影響，這導(dǎo)致鉤介幼蟲在寄主魚上脫落持續(xù)期存在較大差異[25]，給變態(tài)發(fā)育有效積溫和生物學(xué)零度估算帶來較大誤差。采用體外培養(yǎng)技術(shù)可有效降低溫度變化、營(yíng)養(yǎng)差異對(duì)幼蟲變態(tài)發(fā)育帶來的影響，更加科學(xué)對(duì)有效積溫和生物學(xué)零度的估算。此外，本研究也表明：在體外培條件下，溫度越高，幼蟲完成變態(tài)發(fā)育的持續(xù)期越短；但在相同培養(yǎng)條件下，幼蟲變態(tài)時(shí)間仍存在一定差異，這可能與幼蟲個(gè)體質(zhì)量差異有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用體外培養(yǎng)技術(shù)獲得了以鳙魚血漿、馬血清、胎牛血清為營(yíng)養(yǎng)源的褶紋冠蚌稚蚌，對(duì)獲得稚蚌的后期生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行跟蹤觀察。結(jié)果表明：有多種血漿（血清）可以使褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育，但變態(tài)率、稚蚌成活率、稚蚌生長(zhǎng)率不同，以鳙魚血漿為營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)配方最適宜褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育及稚蚌生長(zhǎng)。