孫夢玲,王彬,陳友明,薛暉
(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇 南京 210017)
克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱小龍蝦,屬節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼綱(Crstacea),十足目(Decapoda),是目前我國養(yǎng)殖最廣的淡水螯蝦品種[1],在我國長江中下游地區(qū)廣泛養(yǎng)殖,其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者的青睞。2017年江蘇省小龍蝦養(yǎng)殖面積約1 400 000×667 m2,總產(chǎn)值達(dá)450億元,在產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大的同時,病害的發(fā)生成為了阻礙其發(fā)展的重要原因之一。
白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一種具有囊膜的桿狀病毒[2],地理分布廣、流行范圍大、傳染性強(qiáng)、發(fā)病時間短,目前尚無有效的藥物能夠控制疫情,是中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)養(yǎng)殖中的主要病原[3-4]。研究表明WSSV具有廣泛的宿主,可以感染甲殼綱十足目的大部分動物[4]。近年來發(fā)現(xiàn)在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中也廣泛流行,給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。
該次調(diào)查共選取金湖、泗洪、盱眙、高淳、武進(jìn)、及揚(yáng)中為病害監(jiān)測點(diǎn)及樣品采集點(diǎn),各測報點(diǎn)定期匯報最新病情,同時實(shí)地走訪發(fā)病塘口,了解發(fā)病歷史、發(fā)病季節(jié)及發(fā)病癥狀。在每個采集點(diǎn)隨機(jī)選取養(yǎng)殖戶5戶進(jìn)行樣品采集,采樣時間為2018年4月至2018年6月,每月采集樣本1次,每批次每個養(yǎng)殖戶塘口隨機(jī)選取克氏原螯蝦10只,將活體置于保溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi),直接取活體鰓組織約100 mg,用于PCR檢測,剩余部分收集于eppendorf管內(nèi)并編號后置于-80℃冰箱儲存。
Takara universial genomic DNA抽提試劑盒購于南京浩嘉生物醫(yī)藥有限公司,PCR反應(yīng)Mix購于南京唯贊生物科技,100 bp DNA ladder購于南京唯贊生物科技,PCR儀為Biometra T-Gradient Thermoblock,電泳儀及凝膠成像儀為BIO-RAD,恒溫金屬浴為Bioer CHB-202,冷凍離心機(jī)為Eppendorf 5417R。
將活體取出的鰓組織混合后剪碎并稱取0.05 g組織,參照組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行組織DNA提取。
檢測方法采用江蘇省水生動物疫病預(yù)防控制中心的對蝦白斑綜合病毒檢驗(yàn)方法。槽式PCR引物分別為:槽式第一步引物:146F1:5'-ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG-3'146R1:5'-TAA TGC GGG TGT AATGTTCTT ACG A-3’擴(kuò)增1 447 bp的片段,槽式第二步引物146F2:5'-GTA ACT GCCCCT TCC ATC TCC A-3’146R2:5'-TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T-3'擴(kuò)增上述片段中的941 bp片段,內(nèi)參PCR引物:146F3:5'-TGC CTT ATC AGC TNT CGA TTG TAG-3'146R3:5'-TTC AGNTTT GCA ACC ATACTT CCC-3'擴(kuò)增十足類動物DNA中848 bp片段。檢測反應(yīng)體系統(tǒng)一為:Q2F(10 mM)1 uL,Q2R(10 mM)1 uL,模板 DNA 5 uL,PCR mix 25 uL,ddH2O 18 uL,總反應(yīng)體積為25 uL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,進(jìn)行30個循環(huán);72℃充分延伸10 min,后4℃保存待檢測。
取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠含量為1%(提前加入核酸染料 Gold View),電壓120 V,電泳時間為35 min,電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。
不同時期不同養(yǎng)殖區(qū)的克氏原螯蝦WSSV檢出率見表1,金湖和泗洪兩地的在4、5、6三個月內(nèi)均有WSSV檢出,并且在5月檢出率最高,泗洪達(dá)32%,金湖達(dá)24%,高淳及武進(jìn)兩地檢出率較低,僅在5月有檢出,數(shù)據(jù)分別為4%及8%,且所采集養(yǎng)殖戶塘口小龍蝦并未發(fā)病。揚(yáng)中克氏原螯蝦WSSV在采樣階段有持續(xù)檢出,但較蘇北地區(qū)檢出率低。
表1 不同時期克氏原螯蝦WSSV檢出率
WSSV被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為需向OIE申報的疾病,在對蝦中發(fā)生時病死率高,死亡快,克氏原螯蝦在感染W(wǎng)SSV后發(fā)病較對蝦慢,病死率也較對蝦低,因此曾作為病例研究的模式生物。近年來隨著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,苗種與產(chǎn)品流通空間的擴(kuò)展,使WSSV在克氏原螯蝦中傳播迅速,加之養(yǎng)殖戶許多不科學(xué)的養(yǎng)殖手段及部分養(yǎng)殖戶為克氏原螯蝦提供的生長環(huán)境較差,由白斑病引起的死亡造成損失較大。該次流行病學(xué)調(diào)查選取蘇南及蘇北各3個養(yǎng)殖區(qū),采集時間覆蓋克氏原螯蝦生長及上市交易的主要時段,對江蘇省內(nèi)的WSSV覆蓋及發(fā)生情況進(jìn)行了初步了解。WSSV的傳播是受溫度影響的,這一點(diǎn)從檢測結(jié)果中得到印證,在5月,氣溫達(dá)到25℃以上,WSSV的檢出率明顯提高,并且開始發(fā)生死亡,4月溫度相對較低,檢出率也低,到6月時,溫度升高,最高溫度可達(dá)到30℃,同時池塘內(nèi)龍蝦因前期售賣捕撈的原因,密度大大降低,控制WSSV的傳播與發(fā)生。就養(yǎng)殖區(qū)域看,蘇北地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積廣,產(chǎn)量高,流通量大,因此在相應(yīng)時段WSSV的檢出率要高于蘇南地區(qū)。溫度是影響病害發(fā)生的重要因素,因此在生產(chǎn)養(yǎng)殖中,做好高溫來臨前的防治工作十分必要,可以提前補(bǔ)充免疫增強(qiáng)劑,增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。高密度大范圍的養(yǎng)殖不可避免得會發(fā)生病害,因此控制養(yǎng)殖環(huán)境,做好苗種檢疫,不用發(fā)病塘口的親蝦及種蝦,加強(qiáng)親本及苗種的檢驗(yàn)檢疫,建立SPF親本保護(hù)及苗種繁育基地,從源頭切斷WSSV的發(fā)生。