氨氮對對蝦毒性的風(fēng)險(xiǎn)評估

傅純潔 ，尼倩 ，葛溧 ，鄭偉 ，董志國 ，葛紅星

（1.東?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，連云港 222300；2.淮海工學(xué)院圖書館，連云港 222005；3.東?？h海洋與漁業(yè)局，江蘇 連云港222300；4.淮海工學(xué)院/江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005）

隨著集約化養(yǎng)殖的推廣和發(fā)展，對蝦養(yǎng)殖也得到了迅猛的發(fā)展。然而，由于高密度養(yǎng)殖過程中配合飼料的大量使用及對蝦排泄物的積累，導(dǎo)致了水體中無機(jī)氮等環(huán)境脅迫因子的大量積累，嚴(yán)重影響了對蝦的生長和繁殖。在對蝦養(yǎng)殖水體中，無機(jī)氮主要包括氨氮（NH3-N）、亞硝酸鹽氮（NO2-N）和硝酸鹽氮（NO3-N）。一般認(rèn)為，氨氮和亞硝酸鹽氮對對蝦有毒害作用而硝酸鹽氮無毒害作用。其中，氨在水體中主要有2種形式：離子氨（NH4+）和非離子氨（NH3），非離子氨具有脂溶性，能穿透細(xì)胞膜毒害鰓組織。因此，氨氮的毒性是主要的。水體中氨氮超過對蝦耐受限度時，氨氮能直接損害對蝦的鰓組織，使腎和肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化[1-4]，嚴(yán)重影響對蝦的呼吸、蛻皮和排泄等正常生理功能，導(dǎo)致對蝦對病原微生物抵抗力的下降，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。近年來，風(fēng)險(xiǎn)分析隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中病害的暴發(fā)越來越受到重視。風(fēng)險(xiǎn)評估，以實(shí)際安全為目的，對養(yǎng)殖過程中固有的或潛在的危險(xiǎn)源進(jìn)行定性和定量分析，掌握發(fā)生危險(xiǎn)的可能性及其危害，從而制定出降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)措施和管理決策的一項(xiàng)工程。王群[5]等以毒理學(xué)數(shù)據(jù)作為主要依據(jù)，從食品安全的角度對孔雀石綠在水產(chǎn)品中殘留的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了分析。馬妍[6]等則把風(fēng)險(xiǎn)評估應(yīng)用到對蝦養(yǎng)殖過程中，分析了副溶血弧菌引起對蝦病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。然而，養(yǎng)殖水體中重要生態(tài)因子氨氮對對蝦養(yǎng)殖的風(fēng)險(xiǎn)評估卻鮮見報(bào)道。該文按照風(fēng)險(xiǎn)評估程序，以毒理學(xué)數(shù)據(jù)作為主要依據(jù)，對氨氮對對蝦生長的毒害作用進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，探討降低養(yǎng)殖過程中氨氮對對蝦養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)的措施，為對蝦的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 養(yǎng)殖水體中氨氮來源

蝦池中氨氮來源主要有兩條途徑：一是剩餌、糞便及水生生物殘?bào)w等含氮有機(jī)物被微生物氨化作用后產(chǎn)生。對蝦攝食過程中由于啃食，只有部分飼料被對蝦攝食；在對蝦進(jìn)食1 h后，餌料排空量達(dá)50%～70%[7]，攝食的飼料中，僅85%的氮被對蝦同化[8]。二是對蝦為排氨型生物，除少量的尿素氮和尿酸氮，含氮分泌物中40%～90%以氨氮形式直接由鰓上皮組織排出體外。

水體中氨氮等含氮化合物部分通過細(xì)菌、浮游生物進(jìn)入再循環(huán)途徑，最終以對蝦或者其他生物形式輸出，其他大部分以溶解態(tài)或者是固體沉積物形式存留在水體或者底泥中，直接導(dǎo)致養(yǎng)殖水體及其鄰近水體和底棲生態(tài)營養(yǎng)鹽負(fù)荷的顯著增加。主要表現(xiàn)為氨氮、亞硝酸鹽氮及硝酸鹽氮在水體中遷移和轉(zhuǎn)化的阻滯。尤其在對蝦養(yǎng)成中后期，隨著蝦體的增大，投餌量明顯增加，對蝦排泄量及殘?bào)w也隨之增加，導(dǎo)致水體中菌群比例失調(diào)進(jìn)而引起病原體增加，甚至導(dǎo)致病害的暴發(fā)性流行。

2 毒理學(xué)數(shù)據(jù)

風(fēng)險(xiǎn)評估以毒理學(xué)為主要依據(jù)，一般需要進(jìn)行特殊毒性實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)毒性實(shí)驗(yàn)[5]，采取定性描述和定量分析相結(jié)合的方法對風(fēng)險(xiǎn)作出全面的評估。

2.1 急性毒性試驗(yàn)

當(dāng)對蝦進(jìn)入高濃度的氨氮水體后，活動明顯異常，狂游、打旋，隨著實(shí)驗(yàn)時間的進(jìn)行，對蝦出現(xiàn)沉底、靜臥，附肢顫抖等癥狀，死亡后體色由透明變成渾濁的乳白色。氨氮對對蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)研究較為豐富，以日本對蝦[9-12]為例，如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)，幼體發(fā)育過程中，對氨氮的敏感性較強(qiáng)。水溫和pH接近的條件下，隨著對蝦的生長，對蝦抗氨氮的能力有增強(qiáng)的趨勢，故育苗期間應(yīng)該嚴(yán)格控制水體中氨氮的含量。

水溫27℃、pH值8.15、鹽度20.0條件下，氨氮對體長5 cm的凡納濱對蝦的24、48、72、96 h的半致死濃度分別為 62.23、40.74、31.44、26.67 mg/L[12]。實(shí)驗(yàn)對蝦血氨濃度隨水體中氨氮濃度的加大而升高，堿性磷酸酶的活性先上升后下降，最終并趨于平緩。隨著氨氮對對蝦脅迫時間的延長，對蝦抗氨氮的能力減弱，血液生化指標(biāo)的改變，表明氨氮的脅迫，影響了對蝦對氨氮的排泄作用，降低了其非特異性免疫系統(tǒng)的功能。

高濃度氨氮脅迫脊尾白蝦后[13]，通過實(shí)時熒光定量RT-PCR對脊尾白蝦熱休克蛋白HSP70的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，急性氨氮脅迫后引起肝胰腺和肌肉等組織中該基因的高表達(dá)，表明氨氮能夠引起對蝦的抗應(yīng)激反應(yīng)，然而其反應(yīng)機(jī)理仍缺乏深入的探索。

2.2 長期毒性

表1 氨氮對凡納濱對蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)

日本對蝦稚蝦在鹽度34，pH值 8.21，溫度25.5 ℃，總氨氮濃度分別為 0（對照組）、5、10、20和30 mg/L的海水中培育60 d[4]，病死率分別為0、6.7%、26.7%、70.0%和 86.7%，蛻皮頻率增加，10、20和30 mg/L試驗(yàn)組對蝦體長明顯小于對照組（P＜0.05），隨著氨氮濃度的增加，影響了對蝦的變態(tài)、體長等發(fā)育和存活情況。

長期低濃度氨氮的脅迫，可以引起對蝦行為和組織的病理變化。中國對蝦幼蝦在30 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)中，隨著剩餌和排泄物的積累，水體氨氮濃度逐漸增大到0.032 mg/L，實(shí)驗(yàn)蝦體長明顯小于對照組，多數(shù)個體自凈能力和適應(yīng)性下降，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肝胰腺異常組織增多；鰓絲水腫，局部細(xì)胞空泡化；胃局部細(xì)胞也空泡化，上皮層增厚；中腸上皮局部細(xì)胞裂解[14]。

1 mg/L非離子氨氮脅迫羅氏沼蝦，7 d后電鏡觀察其纖維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞中透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和線粒體數(shù)量少于無氨氮組[15]，表明1mg/L非離子氨氮對羅氏沼蝦血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有顯著影響。

10～12 cm的健康凡納濱對蝦在氨氮濃度為0.05 mg/L（對照組）、0.15、0.75、1.50 和 3.00 mg/L 水體中飼養(yǎng)14 d發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組對蝦的血清PO、SOD、CAT和ACP活力顯著低于對照組，使用副溶血弧菌感染后，各實(shí)驗(yàn)組的對蝦抗病力顯著低于對照組[16]。病害的發(fā)生，是對蝦、病原和環(huán)境相互作用的結(jié)果，長期氨氮的脅迫，增加了對蝦對病原的易感染性。

2.3 發(fā)育毒性

氨氮危害對蝦幼體的變態(tài)發(fā)育。日本對蝦稚蝦在鹽度34 ng/L，pH值 8.21，溫度25.5℃，氨氮濃度分別為 0（對照組）、5、10、20和 30 mg/L 的海水中培養(yǎng)60 d，病死率隨著氨氮濃度的升高而增高，分別為0、6.7%、26.7%、70.0%和86.7%；第1次和第2次蛻皮間隔時間隨著氨氮濃度的增高呈現(xiàn)縮短的趨勢，分別為 21.9、19.2、17.7、14.6 和 10.3 d；體長、體質(zhì)量隨著氨氮濃度的升高而明顯低于對照組[4]。

氨氮脅迫脊尾白蝦糠蝦幼體后，其蛻殼變態(tài)明顯受到高濃度氨氮的抑制作用，其肌肉組織細(xì)胞中RNA/DNA的含量比值也明顯下降，表明高濃度的氨氮抑制糠蝦發(fā)育過程中的蛻殼變態(tài)及生長代謝過程[17]。

排除其他脅迫因子的干擾，氨對凡納濱對蝦蚤狀幼體、糠蝦、體長0.52 cm和5.00 cm安全濃度分別為0.86、0.74、0.79和 2.667 mg/L?？梢?，隨著凡納濱對蝦幼體的生長發(fā)育，其抵抗氨氮毒性的能力有明顯增加。

2.4 聯(lián)合毒性

氨易溶于水，在水體中水解，存在以下平衡：NH3.H2O==NH4++OH-。該平衡受到pH，水溫和鹽度等的影響，水體中分子氨的比例與水溫和pH值呈現(xiàn)正相關(guān)，與鹽度和溶解氧呈負(fù)相關(guān)。水體中其他生態(tài)因子可以影響氨氮對對蝦的毒性作用。

斑節(jié)對蝦在鹽度分別為 5、10、15、20和 25等梯度下進(jìn)行氨氮急性攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨氮的安全濃度分別為 1.3、2.1、2.2、3.2 和 4.4 mg/L；在 pH 值為8.0，水溫 20 ℃條件下，南方濱對蝦幼體（15±0.7）mm在鹽度為5、20、35水平下在不同濃度氨氮水體中進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著鹽度的升高，對蝦對氨氮的敏感度分別增加了103.3%，69.2%，46.7%和33.4%，與對照組相比，耗氧分別增加81.4%，99.2%和137.3%，排氨水平增加64.3%，87%和112.5%[18]。以上實(shí)驗(yàn)表明，鹽度對氨氮的毒性影響較大，隨著鹽度的降低，氨氮的安全濃度越??；鹽度的高低對對蝦的代謝等生理活動也有較大的影響。

正常溶氧5.5～6.0 mg/L條件下，非離子氨對中國對蝦48 h和96 h的半致死濃度分別為1.36和0.98 mg/L；過飽和溶氧10～12 mg/L條件下，48 h和96 h的半致死濃度分別為2.37 mg/L和1.52 mg/L[19]。正常溶氧條件下，非離子氨對羅氏沼蝦48 h和96 h的半致死濃度分別為1.50和0.83 mg/L；而高溶氧條件下，非離子氨對羅氏沼蝦48 h和96 h的半致死濃度分別為2.13和1.425 mg/L[20]。以上數(shù)據(jù)表明，正常溶氧和高溶氧條件下，氨氮對對蝦均有毒性，與正常溶氧相比，高溶氧可以明顯降低氨氮對對蝦的毒性。

pH和總氨氮的大小決定了水體中非離子氨的數(shù)量，有研究認(rèn)為，pH增加一個單位，而其他條件不變的情況下，非離子氨濃度百分?jǐn)?shù)則增加10倍，因此，pH對氨氮的毒性大小有較大的影響。斑節(jié)對蝦在pH值為7.0、7.5、8.0和8.5梯度下，在氨濃度為8×10-6mg/L時，前期溞狀幼體的半致死時間（LT50）由101.09 h減少到25.16 h；在氨濃度24×10-6mg/L時，糠蝦幼體的LT50由115.79 h減少到11.26 h；在52×10-6mg/L氨中，后期幼體的LT50由51.41 h減少到22.58 h[4]。以上數(shù)據(jù)表明，隨著pH值的升高，氨氮對對蝦的毒性增強(qiáng)。

3 降低風(fēng)險(xiǎn)的對策

由上述可知，隨著對蝦的生長發(fā)育，抗應(yīng)激功能不斷完善，其對氨氮毒害的能力增強(qiáng)。以日本對蝦幼蝦[9]為例，氨氮對蚤狀幼體毒性最強(qiáng)，其安全濃度為0.047 mg/L；對蝦發(fā)育到糠蝦幼體階段，抗氨氮能力增強(qiáng)，其安全濃度為0.066 mg/L。凡納濱對蝦[11]發(fā)育過程中也有類似的特征。國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，養(yǎng)殖水體中非離子氨的濃度不得大于0.05 mg/L。水體中氨氮對對蝦生長造成脅迫甚至直接毒害作用，然而，對蝦屬于排氨型生物，自身通過鰓等組織直接排泄氨于水體，同時水體中剩餌、糞便等也會分解成大量氨氮。因此，水體中氨氮不可能除盡；另外，隨著水體中氨氮濃度的降低，去除成本也急劇增加。因此建議，育苗期間，應(yīng)該嚴(yán)格控制水體中氨氮濃度，確保非離子氨濃度不高于0.05 mg/L，隨著對蝦的生長發(fā)育，水體中氨氮的濃度可以高于0.05 mg/L，但不能高于其生長階段的安全濃度。

對蝦養(yǎng)殖過程中，病害的發(fā)生是對蝦、養(yǎng)殖環(huán)境及病原相互作用的結(jié)果。因此，降低氨氮對對蝦的毒害作用，首先應(yīng)該降低水體氨氮的濃度。在養(yǎng)殖過程中，確定適當(dāng)放養(yǎng)的密度，投餌遵循“少量多次”的原則，經(jīng)常排出剩餌、殘肢等，保證充足的溶解氧，調(diào)節(jié)pH值在7.6～8.4之間，保持鹽度的穩(wěn)定性。同時，可以從以下方面降低氨氮的濃度：①應(yīng)用生物絮團(tuán)技術(shù)；②水體中培養(yǎng)藻類；③調(diào)節(jié)水體中C/N；④運(yùn)用臭氧技術(shù)；⑤采用吸附劑應(yīng)急等。

氨氮的毒性與溫度、酸堿度和溶解氧等生態(tài)因子相關(guān)。在一定的范圍內(nèi)，對蝦的生長和代謝隨著溫度的升高而增強(qiáng)，降溫成本過高也不利于對蝦生長。因此，氨氮濃度不變的情況下，可以通過調(diào)節(jié)水體酸堿度和溶解氧來減少非離子氨的比例，控制氨氮的毒害作用。養(yǎng)殖過程中，運(yùn)用微孔增氧技術(shù)或者使用液氧可以有效提高水體溶解氧。微孔技術(shù)能有效提高溶解氧，成本較低，但養(yǎng)殖過程中可能發(fā)生因微孔堵塞而斷氣的危險(xiǎn)，使用過程中應(yīng)該經(jīng)常巡視供氣情況；液氧技術(shù)供氧穩(wěn)定，可以有效提高溶解氧但成本較高，適用于大型工廠化對蝦養(yǎng)殖。水體堿性過高時，可以適當(dāng)加注新水，同時通過加酸、去堿或者生物調(diào)控等措施實(shí)現(xiàn)。加酸主要是通過添加醋酸或者是鹽酸等酸性物質(zhì)，使用過程中應(yīng)該注意防止局部酸中毒；去堿主要指添加明礬等物質(zhì)生成膠體或沉淀達(dá)到去除水體中陽離子或者氫氧根的目的；向水體添加蔗糖等調(diào)節(jié)水體中C/N的比值，可以有效調(diào)控水體中浮游植物、浮游動物和細(xì)菌的比例，達(dá)到生物調(diào)控pH的目的。

氨氮對對蝦的毒性作用的機(jī)理并不十分清楚，對蝦對氨氮毒害作用的應(yīng)激機(jī)理也不明確，所以應(yīng)該重點(diǎn)從以下幾個方面加大研究力度：充分運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和方法，探討對蝦體內(nèi)氨轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒代謝相關(guān)機(jī)理；研究與氨氮脅迫相關(guān)的非特異性免疫系統(tǒng)，從營養(yǎng)學(xué)角度增強(qiáng)對蝦抗氨氮的能力；探討氨氮對對蝦模式免疫識別受體相關(guān)通路的影響等。