麒麟丸對(duì)弱精子癥大鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制探討Δ

劉勝京 郭博達(dá) 郭 軍 晏 斌 王 福 余國(guó)今 高慶和** 張繼偉

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)（北京 100029）；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科（北京 100091）3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院（北京 100730）；4.北京醫(yī)院泌尿外科（北京 100730）

弱精子癥指精液中前向運(yùn)動(dòng)精子比例低于32%或前向運(yùn)動(dòng)與非前向運(yùn)動(dòng)精子之和的比例低于40%的病癥，主要特征表現(xiàn)為精子的前向運(yùn)動(dòng)能力低下。目前西醫(yī)治療效果不甚理想，中醫(yī)藥治療弱精子癥歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富，具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)[1，2]。麒麟丸是由制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿、菟絲子等15 味中藥組成的上市中成藥，在治療弱精子癥方面的療效已在臨床中得到廣泛證實(shí)[3-6]。 本實(shí)驗(yàn)采用奧硝唑所致弱精子癥大鼠模型，擬通過(guò)L-肉堿相關(guān)通路探討麒麟丸對(duì)生殖系統(tǒng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

材 料

一、主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

麒麟丸（廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930034），左卡尼汀口服溶液（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372），奧硝唑膠囊（西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司， 批號(hào)： 國(guó)藥準(zhǔn)字H20031257），左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司提供， 批號(hào)：JJ0731RA14），TRIZOL（10296028，Invitrogen），無(wú)水乙醇（10009218，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（10009218，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DEPC （MD911875，MDL），UltraPure Agarose（165 00100，ABI-invitrogen），SuperScript III RT 逆 轉(zhuǎn) 錄kit（11752050，ABI-invitrogen），Sybr qpcr mix （4472920，ABI-invitrogen）。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，均由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2018-00090， 共計(jì)40 只。 大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)環(huán)境中，均自由采食、飲水，室溫（25±2）℃，12h/12h 光暗周期。

三、主要儀器設(shè)備

Waters e2695 型高效液相色譜儀 （配備2998 型PDA 檢測(cè)器），熒光定量PCR 儀（StepOne Software，Applied biosystems），電子天平（十萬(wàn)分之一，Mettler Toledo），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（MIKRO 22R，Hettich），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Legend micro 21R，Thermo Fisher），光學(xué)顯微 鏡（DM3000，Leica），移液器（0.5～10 μL，2～20 μL，100～1000 μL，Eppendorf），渦旋混合儀（XW-80A，其林貝爾），分光光度計(jì)（Nanodrop lite，Thermo Fisher）。

方 法

一、造模并分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后， 將40 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為4 組，每組10 只，稱量后記錄體質(zhì)量并進(jìn)行編號(hào)。 根據(jù)文獻(xiàn)采用奧硝唑（ORN）所致的大鼠生殖功能損傷機(jī)制建立弱精子癥小鼠模型[7]。 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選定ORN 灌胃劑量為400mg/（kg·d），連續(xù)灌胃28 d。 因ORN 水溶性差，故ORN 用0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC2Na）配制，均為每日新鮮配制。麒麟丸給藥劑量為1.62 g/(kg·d)，相當(dāng)于麒麟丸產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中每人每日口服劑量（18 g/d）。（具體分組見(jiàn)表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

二、大鼠精液質(zhì)量檢測(cè)

大鼠灌胃連續(xù)4 周，于末次給藥24h 后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)附睪后稱量，取左側(cè)附睪尾，放入生理鹽水清洗后（37℃預(yù)熱），迅速放入M199 培養(yǎng)基（1 mL，37℃），剪開(kāi)附睪尾使精子流出，放入培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃），孵育3 min。孵育結(jié)束后吹打混勻，選取血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板取5 μL 精子懸液加入到100 μL M199 培養(yǎng)基中，按照1∶20 的比例進(jìn)行稀釋，吸取10 μL 稀釋后的精子懸液，滴于計(jì)數(shù)板蓋玻片的邊緣使精子懸液自動(dòng)滲進(jìn)計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)，并用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行精子活力分級(jí)檢測(cè)。

三、高效液相色譜法測(cè)定附睪L-肉堿含量

采用高效液相色譜法測(cè)定附睪中的L- 肉堿含量。色譜條件為：色譜柱為Waters SunFireTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱前預(yù)處理，甲醇：0.3 g/L 十二烷基磺酸鈉 （SDS） 的磷酸緩沖液（pH2.4）=5：95， 以1.0 mL/min 的流速?zèng)_柱子40 min；流動(dòng)相，甲醇：磷酸 緩沖 液（pH2.4）=20∶80，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。 取適量左旋肉堿對(duì)照品，精密稱定后，加入50%乙腈水溶液，制成每1 mL 含左旋肉堿1 mg 的溶液。

取上述對(duì)照品溶液，用50%乙腈水溶液逐級(jí)稀釋，得 濃度 為1000、500、250、125、62.5、31.25 mg/L 6 個(gè) 不同濃度的對(duì)照品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程為Y=354 X + 726，r2=0.9997。表明左旋肉堿濃度在31.25～1000 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

四、RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)附睪OCTN2 mRNA 表達(dá)

迅速?gòu)囊旱腥〕龃笫笥覀?cè)附睪頭、體、尾組織各400mg，加入Trizol（1 mL/100 mg）冰浴研磨，形成組織勻漿。 在組織勻漿中加入氯仿， 振蕩混勻， 靜置5min后，4℃12000×g離心10min， 取 上 清加 異 丙 醇 提 取RNA，棄上清，經(jīng)75%乙醇洗滌后，溶于DEPC 水，獲得RNA 原液。 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度 （A 值），A260/A280 值為1.82，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。 按照superscript III （invitrogen） 試劑盒步驟進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)形成cDNA 第 一鏈。 用ABI 7900 qPCR 儀 按95℃、94℃、60℃、72℃，2min、20s、20s、30s 條件， 按表2 中引物序列，進(jìn)行40cycle 擴(kuò)增。

表2 引物序列

五、睪丸病理切片

取大鼠左側(cè)睪丸，進(jìn)行稱量、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片操作后進(jìn)行HE 染色，在光鏡下進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察睪丸結(jié)構(gòu)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析， 采用LSD進(jìn)行組間比較。數(shù)據(jù)采用±s表示，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精子濃度及總活力

由表3 可見(jiàn)，模型組與空白組相比，精子濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），精子總活力明顯下降（P＜0.01）。麒麟丸組和左卡尼汀組與模型組相比， 精子濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），精子總活力明顯上升（P＜0.05）。

表3 各組治療前后精子濃度及總活力比較（n=10，±s）

表3 各組治療前后精子濃度及總活力比較（n=10，±s）

注：與空白組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 精子濃度（106/mL） 總活力（%）空白組 37.29±11.41 60.25±8.02模型組 34.72±10.73 45.01±6.7**麒麟丸組 47.82±15.18 60.28±5.27#左卡尼汀組 46.95±5.68 58.44±5.47#

二、附睪肉堿含量

高效液相色譜法測(cè)定左旋肉堿出峰時(shí)間2.96 min，各組代表性圖譜見(jiàn)圖1，定量結(jié)果見(jiàn)表4。 與空白組比較，模型組肉堿含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸組和左卡尼汀組肉堿含量明顯增高（P＜0.01）。

圖1 各組附睪L-肉堿代表性圖譜

表4 各組附睪L-肉堿含量比較（n=10，±s）

表4 各組附睪L-肉堿含量比較（n=10，±s）

注： 與空白組比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 左旋肉堿含量（mg/L）空白組 4091.2±176.2模型組 2990.2±179.5**麒麟丸組 8681.3±118.9##左卡尼汀組 7659.4±142.6##

三、OTCN2 RNA 的表達(dá)

與空白組組比較， 模型組OTCN2 mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)；左卡尼汀組和麒麟丸組OTCN2 mRNA表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 干預(yù)后各組OTCN2 mRNA 表達(dá)情況比較

四、對(duì)睪丸組織病理的影響

用光學(xué)顯微鏡對(duì)HE 染色后的大鼠睪丸形態(tài)組織進(jìn)行觀察，可見(jiàn)空白組的大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，生精小管形態(tài)正常，其管腔明顯，為正常類圓形，排列整齊緊密， 基底膜完整， 管腔內(nèi)可見(jiàn)豐富的精子及精子細(xì)胞，層次清晰，各級(jí)細(xì)胞分裂活躍；間質(zhì)細(xì)胞在小管間均勻分布。 模型組可見(jiàn)大量變性、萎縮等異常結(jié)構(gòu)的不規(guī)則分布的生精小管， 可見(jiàn)狹小或部分完全閉合的管腔，管腔內(nèi)精子及生精細(xì)胞數(shù)量少，排列不整齊，異常形態(tài)數(shù)量增多，各級(jí)生精細(xì)胞分裂不活躍；間質(zhì)明顯減少，上皮細(xì)胞變薄并伴有脫落。 麒麟丸組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織， 與模型組相比， 生精小管結(jié)構(gòu)基本完整，管腔內(nèi)生精細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且分裂較為活躍，排列緊密；間質(zhì)細(xì)胞分布較均勻，生精上皮細(xì)胞可見(jiàn)較為明顯恢復(fù)（圖3）。

圖3 光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)變化（×200）

討 論

弱精子癥是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一， 其病因復(fù)雜，與內(nèi)分泌因素、生殖道感染、染色體異常、隱睪、精索靜脈曲張或全身性疾病等有關(guān)。 目前弱精子癥的機(jī)制研究主要涉及蛋白表達(dá)異常、能量代謝異常、線粒體功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常等[8，9]。

精子在睪丸中產(chǎn)生， 在附睪中精子成熟并獲得運(yùn)動(dòng)和受精能力。 而附睪內(nèi)的L-肉堿（L-Carnitine），又稱左旋肉堿，在附睪中濃度最高，作為轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入線粒體的重要載體，具有啟動(dòng)精子運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)精子成熟及提高精子受精能力的重要作用[10，11]。 目前，已經(jīng)有多項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用肉堿治療少弱精子癥可明顯提高精子的濃度及總活力[12-14]。 在男性生殖系統(tǒng)中, 肉堿的主要獲取方式是肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)從血液中攝取。有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子2（organic cation/carnitine transportor 2，OCTN2） 是附睪轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要分布于附睪、腎臟、心臟等組織。 人類附睪可能依賴OCTN2 轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿進(jìn)入附睪管, 為精子提供能量,促進(jìn)精子成熟[15]。

中醫(yī)學(xué)無(wú)弱精子癥病名，一般將其歸納為精薄、精冷、難嗣等范疇，目前中醫(yī)藥認(rèn)為在少弱精子癥中，腎精虧虛仍是主要病因[16]。 麒麟丸是補(bǔ)腎類中成藥的代表，具有補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血的作用。 本實(shí)驗(yàn)主要基于L-肉堿通路， 對(duì)麒麟丸生殖系統(tǒng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制進(jìn)行探討。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 在精子濃度及總活力方面：與空白組相比，模型組精子濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），總活力明顯下降（P＜0.01）。 與模型組相比，麒麟丸組和左卡尼汀組精子濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），精子總活力明顯上升（P＜0.05）。 附睪L- 肉堿的含量方面：與空白組比較，模型組肉堿含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸組和左卡尼汀組肉堿含量明顯增高（P＜0.01）。 附睪OCTN2 mRNA 的表達(dá)方面：與空白組比較，模型組OTCN2 mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)；左卡尼汀組與麒麟丸組OTCN2 mRNA 表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麒麟丸具有明顯提高奧硝唑造模致弱精子癥大鼠模型精子活力的作用， 其作用機(jī)制可能與其提高附睪L-肉堿的含量和OCTN2 mRNA 的表達(dá)有關(guān)，更詳細(xì)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。