基于Ag/Si-NPA的DNA堿基高靈敏度SERS探測

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(1.鄭州大學(xué) 物理工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.材料物理教育部重點實驗室 河南 鄭州 450001)

0 引言

DNA是生物遺傳信息的載體，而腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)四種DNA堿基則是DNA的基本組成部分，在基因的表達(dá)和復(fù)制過程中扮演著重要角色.由于DNA堿基分子溶解度很低且散射截面較小，因此采用常規(guī)拉曼散射方法很難對其進(jìn)行高靈敏度檢測、分析和研究.表面增強拉曼散射(SERS)技術(shù)為低濃度生物分子的檢測開辟了一個新的方向.在過去十余年中，有關(guān)生物分子SERS探測的研究被廣泛報道，涉及的生物分子探測種類已經(jīng)包括核苷酸分子、蛋白質(zhì)、酶、DNA或RNA堿基等.通過對生物分子的SERS光譜進(jìn)行分析，可以獲得目標(biāo)探測分子的大量信息，如分子的吸附取向、原子或功能基團的吸附行為、分子吸附于金屬表面時的結(jié)構(gòu)變化以及不同分子的共吸附狀態(tài)等.SERS檢測具有非常高的靈敏度，可實現(xiàn)對低濃度DNA堿基的有效探測，甚至可實現(xiàn)單分子檢測.因此，通過對DNA堿基的檢測和吸附行為的研究，有可能進(jìn)一步實現(xiàn)對DNA分子的直接檢測，并有望在未來用于對DNA的快速測序，因而具有重要的基礎(chǔ)研究價值和應(yīng)用前景.

在SERS探測中，目前最常用的活性基底是Ag的膠體和粗糙電極，二者通常采用化學(xué)液相法或電化學(xué)方法進(jìn)行制備.由于膠體粒子易于團聚，而粗糙電極難于實現(xiàn)表面形貌和微觀結(jié)構(gòu)的大面積均勻性.因此，以其作為活性基底進(jìn)行SERS探測時，測量的穩(wěn)定性和重復(fù)性均不夠理想.為改變這一狀況，人們往往通過優(yōu)化制備工藝或采用模板法制備顆粒均勻的金屬納米體系加以補償.文獻(xiàn)[1-2]采用水熱腐蝕技術(shù)制備了一種硅的層次結(jié)構(gòu)，即硅納米孔柱陣列(Si-NPA).以Si-NPA作為襯底，采用簡單的浸漬還原技術(shù)，在Si-NPA上制備了圖案化的Ag納米結(jié)構(gòu)陣列.在此基礎(chǔ)上，文獻(xiàn)[3-4]以Ag/Si-NPA為活性基底，對低濃度的DNA堿基腺嘌呤和熒光生物指示劑羅丹明6G(R6G)進(jìn)行了SERS檢測.結(jié)果表明，Ag/Si-NPA是一種性能優(yōu)異的SERS活性基底，具有靈敏度高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好等優(yōu)點.

本文以Ag/Si-NPA為活性基底，對腺嘌呤之外的其他三種DNA堿基(鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)在活性基底上的吸附行為和SERS增強效應(yīng)進(jìn)行研究.結(jié)果表明，Ag/Si-NPA能夠?qū)NA堿基實現(xiàn)低濃度檢測，對低濃度生物分子進(jìn)行高靈敏度SERS檢測具有很好的潛力.

1 實驗方法

Si-NPA采用水熱腐蝕法制備，其具體制備過程和結(jié)構(gòu)表征見文獻(xiàn)[1-2].制備完成后，將Si-NPA置于空氣中20 h，通過自然氧化過程以改變Si-NPA的表面鈍化狀態(tài)，進(jìn)而控制Ag納米顆粒的沉積量和平均尺寸.隨后，將經(jīng)過自然氧化的Si-NPA在提前配制的濃度為0.01 mol/L的AgNO3溶液中浸漬沉積3 min，用去離子水充分清洗后在空氣中自然晾干，得到Ag/Si-NPA活性基底[3].

配制具有不同濃度的鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的水溶液用于SERS檢測.首先，將Ag/Si-NPA活性基底在0.1 mol/L的KCl溶液中預(yù)處理20 min，以去除Ag/Si-NPA表面可能吸附的雜質(zhì)，而后用去離子水充分清洗干凈.用微量進(jìn)樣器取4 μL配制好的堿基溶液滴于半干的Ag/Si-NPA表面，室溫下自然干燥后進(jìn)行SERS探測.

Ag/Si-NPA的結(jié)構(gòu)、成分和表面形貌分別通過X射線衍射儀(Rigaku D/MAX-3B)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JEOL JSM-6700F)進(jìn)行表征.SERS光譜由顯微拉曼光譜儀(Renishaw，RM2000)測得，激發(fā)波長為633 nm，光斑直徑為1 μm，樣品表面照射功率為0.3 mW，設(shè)備波數(shù)分辨率為1.5 cm-1，光譜收集時間均設(shè)定為10 s.

圖1 Ag/Si-NPA的X射線衍射圖Fig.1 The XRD pattern of Ag/Si-NPA

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag/Si-NPA的結(jié)構(gòu)成分與形貌表征

圖1給出了Ag/Si-NPA的X射線衍射圖.圖中觀察到5個衍射峰，分別位于38.10°、 44.30°、64.40°、77.40°和81.60°.通過與Ag的標(biāo)準(zhǔn)XRD圖譜進(jìn)行比對可以確定，5個衍射峰分別對應(yīng)于來自面心立方結(jié)構(gòu)Ag晶體不同晶面族的衍射，表明通過浸漬沉積法成功實現(xiàn)了金屬Ag在Si-NPA上的沉積生長.

通過掃描電鏡得到Si-NPA和Ag/Si-NPA的表面形貌如圖2所示.圖2(a)給出了Si-NPA的表面形貌，可以觀察到由近似等同、分離完好且垂直于樣品表面規(guī)則排列的火山口狀結(jié)構(gòu)組成的陣列.根據(jù)文獻(xiàn)[5]的研究結(jié)果，所觀察到的火山口狀結(jié)構(gòu)為微米尺度的、高度多孔化的硅柱，孔的平均直徑約為40 nm，孔壁由包裹二氧化硅的硅納米晶粒組成，平均粒徑約為3.4 nm.圖2(b)為Ag/Si-NPA的表面形貌.可以看出，通過浸漬沉積在Si-NPA表面形成了兩種Ag的結(jié)構(gòu)：一種是連續(xù)覆蓋于Si-NPA表面的Ag納米晶粒；另一種則是亞微米量級較大的Ag顆粒.后者存在于硅柱之間的谷底，相互連接形成一種手鏈結(jié)構(gòu).根據(jù)文獻(xiàn)[4]的表征結(jié)果，Ag納米晶粒和較大顆粒的平均尺寸分別約為47.9 nm和587 nm，對于DNA堿基的SERS探測具有較好的效果.

圖2 Si-NPA和Ag/Si-NPA的表面形貌Fig.2 Surface morphologies of Si-NPA and Ag/Si-NPA

2.2 鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的SERS探測

2.2.1鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的分子結(jié)構(gòu) 鳥嘌呤為嘌呤類的有機化合物，其分子結(jié)構(gòu)為由碳原子和氮原子組成的具有特征性的雙環(huán)結(jié)構(gòu)，在C2位帶有一個氨基，C6位與氧原子形成羰基.胞嘧啶則是一種嘧啶堿基，與鳥嘌呤的雙環(huán)結(jié)構(gòu)不同，其分子僅由一個六元環(huán)組成，在C4位帶有一個氨基，C3位與氧原子形成羰基.胸腺嘧啶為組成DNA的另一種嘧啶堿基，和胞嘧啶的結(jié)構(gòu)相似，也是僅由一個六元環(huán)構(gòu)成，在C5位帶有一個甲基，C2和C4位與氧原子形成羰基.

2.2.2鳥嘌呤的SERS探測 圖3為不同濃度鳥嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.圖3(a)給出了鳥嘌呤固體粉末的常規(guī)拉曼光譜作為參比，圖3(b)和圖3(c)分別為濃度為10-5mol/L、10-6mol/L的鳥嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.可以看出，所測得的SERS光譜與常規(guī)拉曼光譜的譜結(jié)構(gòu)基本一致，表明采用SERS光譜技術(shù)可以對低濃度鳥嘌呤溶液進(jìn)行有效探測.

根據(jù)SERS表面選擇定則[7]，垂直于金屬表面的拉曼振動模式將會得到顯著增強，而平行于金屬表面的拉曼振動模式則增強效果較弱.在SERS光譜中觀察到強度明顯增加的、對應(yīng)于面內(nèi)振動模式的拉曼峰，說明鳥嘌呤分子吸附取向應(yīng)為垂直于Ag顆粒表面；而位于380 cm-1的拉曼峰經(jīng)比對，指認(rèn)為來自于C2N3C4C5和N7C8N9C4的環(huán)面扭轉(zhuǎn)振動，表明鳥嘌呤分子并非完全地垂直吸附于基底表面，而是略有傾斜.

(a)鳥嘌呤固體粉末;(b) 10-5 mol/L鳥嘌呤溶液; (c) 10-6 mol/L鳥嘌呤溶液圖3 不同濃度鳥嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.3 The SERS spectra of guanine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

圖4(c)為鳥嘌呤溶液濃度降低至10-6mol/L時的SERS光譜.可以看出，隨著鳥嘌呤溶液濃度的降低，SERS光譜的強度降低，但其峰形和峰位未發(fā)生明顯變化.值得注意的是，歸屬于環(huán)呼吸振動模式的拉曼峰的相對強度降低，表明隨著溶液濃度的降低，鳥嘌呤更趨向于平行吸附于基底表面.

(a) 胞嘧啶固體粉末;(b) 10-2 mol/L胞嘧啶溶液; (c) 10-6 mol/L胞嘧啶溶液圖4 不同濃度胞嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.4 The SERS spectra of cytosine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

圖4(c)為胞嘧啶溶液濃度降低至10-6mol/L時的SERS光譜.可以看出，隨著胞嘧啶溶液濃度的降低，環(huán)呼吸振動模式對應(yīng)的拉曼峰的相對強度降低.另外，較低濃度時在972 cm-1處出現(xiàn)了歸屬于面外搖擺振動的峰，表明當(dāng)溶液濃度降低時，胞嘧啶分子的吸附角度將會有所傾斜.

2.2.4胸腺嘧啶的SERS探測 圖5為不同濃度胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.圖5(a)給出了作為參比的胸腺嘧啶固體粉末的常規(guī)拉曼光譜，圖5(b)和圖5(c)則分別對應(yīng)于濃度為10-2mol/L、10-6mol/L 的胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的理論計算結(jié)果，對SERS光譜中出現(xiàn)的主要拉曼峰進(jìn)行了指認(rèn).與鳥嘌呤和胞嘧啶不同，胸腺嘧啶的環(huán)呼吸振動模式對應(yīng)的拉曼峰位有較大的頻移，由740 cm-1頻移至781 cm-1.文獻(xiàn)[13]研究結(jié)果表明，與環(huán)有關(guān)的振動頻移歸因于金屬表面與π鍵之間的相互作用.因此，環(huán)呼吸振動較大的頻移表明胸腺嘧啶的嘧啶環(huán)與Ag顆粒之間存在著一定的相互作用.

(a) 胸腺嘧啶固體粉末;(b) 10-2 mol/L胸腺嘧啶溶液; (c) 10-6 mol/L胸腺嘧啶溶液圖5 不同濃度胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.5 The SERS spectra of thymine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

通過對比不同濃度胸腺嘧啶溶液的SERS光譜，可以看出，隨著胸腺嘧啶溶液濃度的降低，環(huán)呼吸振動峰的強度下降，表明隨著溶液濃度的降低，胸腺嘧啶分子的吸附角度將會有所傾斜.

2.3 DNA堿基SERS探測的普遍規(guī)律

通過以上分析可以看出，吸附于Ag/Si-NPA表面的堿基在SERS探測中有幾個普遍的規(guī)律.鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶吸附于Ag/Si-NPA活性基底后，雖然收集到的SERS光譜中大多數(shù)拉曼峰位都有明顯的頻移，但光譜結(jié)構(gòu)與其固體粉末的常規(guī)拉曼光譜相比表現(xiàn)出明顯的一致性.在SERS光譜中最強的拉曼峰雖然峰位頻移略有不同，但均歸屬于面內(nèi)環(huán)呼吸振動，鳥嘌呤和胞嘧啶拉曼峰的頻移較小，胸腺嘧啶的峰位頻移較大，與環(huán)有關(guān)的振動頻移歸因于金屬表面與π鍵之間的相互作用.因此，環(huán)呼吸振動拉曼峰的頻移表明三種堿基均是略有傾斜地吸附于基底表面，與胞嘧啶和鳥嘌呤相比，胸腺嘧啶的傾斜角度更小.

圖6 鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的幾何結(jié)構(gòu)以及吸附于Ag/Si-NPA上最可能的空間結(jié)構(gòu)和取向Fig.6 The geometric construction of guanine(G), cytosine(C), thymine(T), and the most probable space configuration and orientation of the molecules adsorbed on Ag/Si-NPA

3 結(jié)論

通過SERS的方法研究了三種DNA堿基(鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)在低濃度時的吸附行為.以Ag/Si-NPA為SERS的活性基底，對不同濃度的DNA堿基進(jìn)行了SERS探測，并與堿基固體粉末的常規(guī)拉曼光譜進(jìn)行了對比分析.通過對比發(fā)現(xiàn)，三種DNA堿基均是略微傾斜地吸附于基底表面，但傾斜角度不同，胸腺嘧啶的傾斜角度要小于鳥嘌呤和胞嘧啶的傾斜角度.不同堿基的吸附位點相似，都是通過羰基和氮原子吸附于Ag原子表面.另外，隨著溶液濃度的降低，堿基分子更趨向平行吸附于基底表面.研究結(jié)果表明，Ag/Si-NPA是一種具有潛力的SERS活性基底，可實現(xiàn)對低濃度生物分子的探測，有望應(yīng)用于DNA快速測序工程.