耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測(cè)及其同源性分析

王 璐，高緒鋒，張鳳麗，胡燕云，黃 穎，徐元宏

臨床上，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)常常引起呼吸道、泌尿道、消化道、血液及其他無(wú)菌部位(如腹腔、胸腔、關(guān)節(jié)等)感染[1]。KPN的分離率呈逐年穩(wěn)步上升趨勢(shì)，且耐碳青霉烯KPN(CRKP)的檢出率也在逐年上升，至2017年，KPN對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率達(dá)到20.9%和24.0%，耐藥率上升幅度高達(dá)8倍[2]。KPN對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥大多是由于其產(chǎn)碳青霉烯酶，尤以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniae carbapenemase，KPC)為主。我院自2018年以來(lái)，CRKP的檢出率逐漸上升，本研究收集2018年4-6月分離自臨床科室的CRKP 40株，進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測(cè)及菌株同源性分析，以期進(jìn)一步了解我院CRKP的耐藥性與分子流行病學(xué)特征，為有效治療和預(yù)防CRKP感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一藥物耐藥定義為CRKP，所有菌株均為連續(xù)分離的非重復(fù)菌株，同一病人同一標(biāo)本只取第1 次分離株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，KPN ATCC1705，KPN ATCC1706，大腸埃希菌ATCC 8739，系安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。KPC、OXA-48、NDM-1陽(yáng)性對(duì)照菌株系中國(guó)人解放軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 MAC平板、BP平板、MH平板及VITEK 2 Compact型全自動(dòng)微生物分析儀和革蘭陰性菌鑒定藥敏卡(GN和GN13)均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，美羅培南藥物敏感性紙片(10 μg)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)購(gòu)自北京三藥公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司，PCR試劑購(gòu)自日本Takara公司，引物交由生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)、鑒定與藥敏方法 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》對(duì)臨床菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)。標(biāo)本分別接種于血平板和麥康凱，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取疑似菌落進(jìn)行種類(lèi)鑒定。菌種鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃VITEK 2 Compact型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行，菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性采用梅里埃VITEK 2 Compact GN 13卡進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)操作及折點(diǎn)判斷依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(CLSI-M100-27)進(jìn)行。

1.2.2 改良Hodge(MHT)試驗(yàn) 將大腸埃希菌ATCC 25922配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海♂?0倍后均勻涂布于MH平板上，在平板中央貼10 μg美羅培南紙片。然后用接種環(huán)挑取單個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌落，以紙片邊緣為起點(diǎn)離心方向劃線接種，35 ℃孵育16～20 h后觀察結(jié)果。以KPN ATCC 1705為陽(yáng)性對(duì)照，KPN ATCC1706為陰性對(duì)照。若被測(cè)菌株線與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交匯處出現(xiàn)大腸埃希菌生長(zhǎng)增強(qiáng)現(xiàn)象，即為陽(yáng)性[3-4]。

1.2.3 改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM試驗(yàn)) 取1 μL過(guò)夜培養(yǎng)的CRKP菌落接種于2 mL TSB 肉湯中，渦旋振蕩15 s，將10 μg美羅培南紙片浸沒(méi)于TSB菌液中，35 ℃孵育4 h。待孵育結(jié)束時(shí)，將美羅培南紙片從TSB菌液中取出，貼于0.5 麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌ATCC25922涂布的MH 瓊脂平板上，35 ℃孵育18～24 h。KPN ATCC1705為陽(yáng)性對(duì)照，KPN ATCC1706為陰性對(duì)照。根據(jù)CLSI M100 27th進(jìn)行結(jié)果判讀[4]。

1.2.4 耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取待測(cè)菌株的基因組DNA作為模板。取無(wú)菌水1 mL加入高壓滅菌后的EP管中，挑取35 ℃、 16～18 h生長(zhǎng)的菌落適量在EP管壁研磨制成菌懸液，然后將菌懸液100 ℃加熱30 min，冷卻至室溫后，高速離心取上清液作為PCR擴(kuò)增的模板。同時(shí)使用多對(duì)特異引物序列進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，按如下設(shè)置擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后變性94 ℃ 45 s、退火55 ℃ 45 s和延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察CRKP菌株是否攜帶待檢的碳青霉烯耐藥基因。將部分?jǐn)U增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在 GenBank 中進(jìn)行比對(duì)分析，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的種類(lèi)和型別[5]。引物序列見(jiàn)表1。

表1 碳青酶烯耐藥基因引物序列

1.2.5 同源性分析 CRKP菌株35 ℃過(guò)夜后，挑取單個(gè)純菌落，將其均勻涂抹于靶板上，放置后滴加1 μL α-腈基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，待干燥，將靶板放入 VITEK MS 儀器中，使用科研庫(kù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。儀器將細(xì)菌蛋白質(zhì)峰圖與數(shù)據(jù)庫(kù)里參考圖譜比較并進(jìn)行多種算法計(jì)算，給出鑒定結(jié)果。可信水平在60.0%～99.9%為可接受結(jié)果。然后在系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行同種細(xì)菌間的聚類(lèi)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 Excel 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序計(jì)算，應(yīng)用 WHONET 5.6軟件對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CRKP的分布情況 CRKP 40株中分離自 ICU 病房的占55%，急診科占15%，呼吸內(nèi)科占10%，普外科一病區(qū)和神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)各占5%，神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū)、腎臟內(nèi)科及腫瘤內(nèi)科各占2.5%。標(biāo)本類(lèi)型中以呼吸道的標(biāo)本居多，占80%，其次是尿液、血液及分泌物各占5%，胸水和腹水各占2.5%。

2.2 藥敏結(jié)果 40株CRKP對(duì)厄他培南及環(huán)丙沙星耐藥率均為100.0%，對(duì)亞胺培南耐藥率為92.5%，對(duì)阿米卡星耐藥率為80.0%，對(duì)三代頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、青霉素類(lèi)耐藥率均超過(guò)90.0%(見(jiàn)表2)。

表2 CRKP菌株對(duì)常用抗生素耐藥情況

2.3 MHT、mCIM 試驗(yàn)及幾種常見(jiàn)的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果

2.3.1 MHT、mCIM 試驗(yàn)結(jié)果 40株 CRKP 中，33株菌 MHT 和 mCIM 試驗(yàn)均為陽(yáng)性，2株菌(9號(hào)和34號(hào))均為陰性，剩下5株菌都是 MHT 試驗(yàn)陽(yáng)性而 mCIM 試驗(yàn)結(jié)果為陰性(見(jiàn)表3)。

2.3.2 幾種常見(jiàn)的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果 KPC、OXA-48、NDM-1 PCR凝膠電泳結(jié)果顯示，32株CRKP攜帶KPC基因，測(cè)序后用Gene Bank進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示32株KPC基因型均是 KPC-2型。此次試驗(yàn)未檢出OXA-48及 NDM-1基因(見(jiàn)表3)。部分試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

表3 MHT、mCIM 試驗(yàn)及幾種常見(jiàn)的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果

2.4 VITEK MS質(zhì)譜儀同源性分析 按照相似度為80%～100%為同一型別的分類(lèi)方法，該40株 CRKP 可分為7個(gè)型別，A 型34株，占85%，是主要型別，B、C、D、E、F及G型各1株，各占2.5%(見(jiàn)圖3)。

3 討論

耐碳青霉烯的腸桿菌科往往對(duì)多種抗生素耐藥嚴(yán)重，治療極其困難，而成為全球范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題，近幾年又以 CRKP 最為突出[6-7]。研究證明，CRKP 的耐藥機(jī)制主要是由于攜帶碳青霉烯酶，以KPC為主，該酶因首次在KPN 中被檢出，因此命名為 KPC[8]，是含有絲氨酸殘基的 A 類(lèi)碳青霉烯酶，由265～269個(gè)氨基酸組成。攜帶 KPC 基因的KPN大多數(shù)為多重耐藥菌，因?yàn)?KPC 基因存在于帶有耐藥性決定因素的大質(zhì)粒上，其中包括對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)等耐藥的質(zhì)粒[9]。CRKP在醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播的因素目前尚未研究清楚，但可能與長(zhǎng)期接觸急性護(hù)理設(shè)施、較高的共病程度、長(zhǎng)期使用抗生素以及長(zhǎng)期使用留置管和中心靜脈導(dǎo)管等有關(guān)，繼而引起感染[10-11]。CRKP 感染的病人，其住院時(shí)間延長(zhǎng)，多數(shù)會(huì)住進(jìn) ICU 病房進(jìn)行搶救治療，且相較于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或?qū)μ记嗝瓜┟舾械腒PN病死率較高[12]。本研究中，CRKP 對(duì)多種抗生素的耐藥性普遍較高，對(duì)頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)的耐藥率都在90.0%以上，與其他報(bào)道[13-15]相似。有研究[16]表明治療時(shí)采用多藥聯(lián)合或選用新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合或許有效。

本次試驗(yàn)中有26株CRKP MHT試驗(yàn)及 mCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性且檢出 KPC 基因，4株 MHT 陽(yáng)性、 mCIM 陰性并攜帶KPC基因。 KPC 基因檢測(cè)陽(yáng)性的菌株 MHT 試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，這與胡仁靜等[17]研究結(jié)果相同。有7株菌 MHT 及 mCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性，但未檢測(cè)到 KPC、OXA-48 及 NDM-1 基因，推測(cè)可能攜帶有其他碳青霉烯類(lèi)耐藥基因，如 VIM、IMP等[18]。還有2株菌 MHT 和 mCIM 試驗(yàn)均為陰性，且未檢出待測(cè)基因，可能與 MHT 和 mCIM 試驗(yàn)在檢測(cè)不同類(lèi)別碳青霉烯類(lèi)基因時(shí)靈敏度不同、菌株攜帶其他碳青霉烯類(lèi)耐藥基因或者存在外膜蛋白丟失等其他非耐藥基因因素有關(guān)。本研究中 CRKP 多為 KPC-2 型，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道[15,19-20]相符，但也有研究[21]認(rèn)為 CRKP 流行菌株多為IMP-4型，但這需要大量數(shù)據(jù)的進(jìn)一步研究。MALDI-TOF MS在過(guò)去十年中給微生物學(xué)診斷工作流程帶來(lái)巨變[22]。研究表明，MALDI-TOF MS除了在微生物鑒定方面以外，在流行病學(xué)分型和耐藥檢測(cè)方面同樣具有巨大的潛力，其分型準(zhǔn)確度與脈沖場(chǎng)凝膠電泳和多位點(diǎn)序列分型大致相當(dāng)，且具有快速、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點(diǎn)[23-25]。本文中采用MALDI-TOF MS 進(jìn)行同源性分析，40株 CRKP分為7個(gè)類(lèi)型，其中A 型34株，占85%，B、C、D、E、F 及 G 型各1株，各占2.5%，以A 型為主，主要集中在ICU病房和急診科，同時(shí)存在于神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科及普外科一病區(qū)，因此我們認(rèn)為，本院存在以A型為主的 CRKP 的流行傳播。

綜上所述，我院 CRKP 耐藥程度較高且有流行播散的趨勢(shì)，因此院感部門(mén)應(yīng)對(duì)重點(diǎn)科室加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，采取適當(dāng)措施，嚴(yán)格控制進(jìn)一步的傳播流行。同時(shí)后續(xù)應(yīng)當(dāng)補(bǔ)充其他耐藥基因檢測(cè)及進(jìn)一步研究是否存在外膜蛋白的丟失及藥物泵出等機(jī)制，為研究CRKP的傳播機(jī)制提供思路。