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      廣玉蘭果實中雙和厚樸酚A提取工藝研究

      2019-02-19 05:47:40張松松李紅梅吳成柱
      關(guān)鍵詞:廣玉蘭溶媒浸膏

      張松松,靳 偉,李紅梅,吳成柱

      廣玉蘭又名荷花玉蘭,是木蘭科木蘭屬植物,為常綠闊葉大葉喬木?!逗现参镏尽分杏涊d廣玉蘭的樹皮、花及葉入藥,具有祛風(fēng)散寒、行氣鎮(zhèn)痛的功效,可治療外感風(fēng)寒頭痛、鼻塞、嘔吐腹瀉、高血壓、偏頭痛等[1]。廣玉蘭中含有多種化學(xué)成分,如生物堿類、黃酮類、木脂素類、萜類、倍半萜內(nèi)酯、脂肪酸類等[2-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[4-7]表明,廣玉蘭具有抗炎、抗氧化、抗驚厥、抑制平滑肌等作用。近期,本課題組對廣玉蘭果實的化學(xué)成分及抗腫瘤活性進(jìn)行研究過程中,首次獲得了新穎結(jié)構(gòu)的新木脂素類化合物雙和厚樸酚A[8]。新木脂素類化合物是由C6-C3骨架的苯丙素氧化聚合而成,具有較強(qiáng)的生物活性,如抗腫瘤作用、肝保護(hù)和抗氧化作用、抗人類免疫缺陷病毒作用等[9]。然而,目前對廣玉蘭果實中有關(guān)雙和厚樸酚A提取工藝的研究未曾報道。因此,本研究以廣玉蘭果實為原料,考察提取溶媒、料液比、浸泡時間及提取次數(shù)等因素,并以L9(34)正交試驗篩選出最佳提取條件,為廣玉蘭資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 儀器 XFB-200型小型粉碎機(jī)(吉首市忠誠制藥機(jī)械廠),梅特勒-托利多XP205型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司),SPD-15C型反相高效液相色譜儀[日本島津企業(yè)管理(中國)有限公司],KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),IKARV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海人和科學(xué)儀器有限公司),Milli-QBiocel型超純水儀(美國Millipore公司),Anke TGL-16B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),色譜柱SunFireTMC18(4.6×250 mm,5 μm,美國Waters公司)。

      1.2 試劑 藥材采集于自蚌埠醫(yī)學(xué)院內(nèi)(經(jīng)鑒定為木蘭科木蘭屬植物廣玉蘭的果實),無水乙醇(分析純)、無水甲醇(分析純)、色譜甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷(天津大茂化學(xué)試劑廠),雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品(本課題組從廣玉蘭中分離純化得到),乙腈(色譜純,美國TEDIA公司),水(雙蒸水,來自Milli-QBiocel 超純水儀)。

      1.3 測定條件和溶液配制

      1.3.1 色譜條件 采用SunFireTMC18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈∶水(75∶25,V/V),流速為1.0 mL/min,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量為20 μL,檢測波長為254 nm。

      1.3.2 供試品溶液的配制 分別稱取8份廣玉蘭果實粉末。第1份:取細(xì)粉末12 g,加水500 mL加熱煮沸45 min,得濾液備用。第2份:取細(xì)粉末12 g,加無水甲醇100 mL熱回流3次,每次1 h,過濾,合并濾液備用。第3份:取細(xì)粉末12 g,加無水甲醇200 mL浸泡48 h,過濾,得濾液備用。第4份:取細(xì)粉末12 g,加無水乙醇100 mL熱回流3次,每次1 h,過濾,合并濾液備用。第5份:取細(xì)粉末12 g,加無水乙醇200 mL浸泡48 h,過濾,得濾液備用。第6份:取細(xì)粉末20 g,加乙酸乙酯100 mL浸泡48 h,過濾,得濾液備用。第7份:取細(xì)粉末20 g,加二氯甲烷100 mL浸泡48 h,過濾,得濾液備用。第8份:取細(xì)粉末20 g,加正己烷100 mL浸泡48 h,過濾,得濾液備用。

      1.3.3 對照品溶液的配制 精密稱取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg,并用色譜甲醇稀釋成不同濃度的對照品溶液。

      1.4 方法學(xué)考察

      1.4.1 專屬性 分別吸取對照品溶液和供試品溶液20 μL,注入HPLC色譜儀,并在上述色譜條件下進(jìn)行分析。

      1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品并將其稀釋成0.94 mg/mL,再將其等倍數(shù)稀釋成9份,其質(zhì)量濃度分別為470.000、235.000、117.500、58.750、29.375、14.688、7.344、3.672、1.836 μg/mL。進(jìn)樣量均為20 μL,測得峰面積。分別吸取上述系列濃度溶液,注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析,并記錄峰面積。

      1.4.3 精密度 取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品1 mg并稀釋成1 mg/mL,在同一天內(nèi)對同一份樣品連續(xù)測定6次,用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來計算日內(nèi)精密度。

      1.4.4 重現(xiàn)性 取廣玉蘭果實粉末正己烷提取的浸膏5.75 mg,用色譜甲醇將其稀釋成5.75 mg/mL,在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測其峰面積和RSD值。

      1.4.5 穩(wěn)定性 取廣玉蘭果實粉末正己烷提取浸膏9.3 mg,用色譜甲醇將其溶解稀釋成9.3 mg/mL,分別于0、2、4、6、8、10、24 h進(jìn)樣,測峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

      1.5 正交試驗 稱取廣玉蘭果實粉末10 g,選擇正己烷為提取溶劑,以料液比(A)、浸泡時間(B)、提取次數(shù)(C)為考察指標(biāo),按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗,因素水平表見表1。

      表1 試驗因素計劃表

      2 結(jié)果

      2.1 方法學(xué)評價

      2.1.1 專屬性考察 按照“1.3.1色譜條件”下進(jìn)行分析,待測組分峰形良好(見圖1)。雙和厚樸酚A(對照品)保留時間為10.8 min,溶媒提取浸膏中雙和厚樸酚A與其他雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離。

      2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X),得線性回歸方程為Y=4.5E+7X-53 724,r=0.9996(n=9),表明雙和厚樸酚A在0.184~470 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

      2.1.3 精密度 取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品并配置成1 mg/mL,在同一天內(nèi)對同一份樣品連續(xù)進(jìn)樣6次,按“1.3.1色譜條件”進(jìn)行分析。用RSD來計算日內(nèi)精密度,RSD為0.68%,表明儀器精密度良好(見表2)。

      2.1.4 重現(xiàn)性 取廣玉蘭果實粉末正己烷提取浸膏5.7 mg,用色譜甲醇將其稀釋成5.7 mg/mL,在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測其峰面積和并計算RSD為1.61%(見表3)。

      2.1.5 穩(wěn)定性 取廣玉蘭果實粉末正己烷提取浸膏9.3 mg,用色譜甲醇將其溶解配制成9.3 mg/mL,分別取常溫放置不同時間(0、2、4、6、8、10、24 h)的供試品溶液進(jìn)行分析,測峰面積并計算RSD值(見表4),RSD為1.39%,表明供試品溶液在常溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

      表2 雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品的精密度試驗結(jié)果

      表3 用正己烷提取廣玉蘭果實粉末的重現(xiàn)性試驗結(jié)果

      2.2 提取工藝的優(yōu)化 取各種溶媒浸泡所得的浸膏進(jìn)樣,通過測得的峰面積進(jìn)行比較(見表5)。從實驗數(shù)據(jù)比較可以發(fā)現(xiàn),正己烷浸泡法提取的有效成分量最多;但為了進(jìn)一步確定正己烷的投料比、浸泡時間、提取次數(shù)等因素的影響關(guān)系,為此設(shè)計了正交實驗。

      表4 廣玉蘭藥材粉末正己烷提取浸膏的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

      表5 各種溶媒提取浸膏的含量測定結(jié)果

      2.3 正交試驗優(yōu)化提取工藝 以雙和厚樸酚A含量為指標(biāo),各因素對正己烷提取結(jié)果影響大小依次為A>B>C,即料液比為最主要影響因素;不同因素內(nèi)各水平對結(jié)果的影響強(qiáng)弱為:A2>A1>A3;B3>B1>B2;C2>C1>C3;其最佳因素水平組合為A2B3C2,即料液比為1∶30、浸泡時間為48 h、提取次數(shù)為3次(見表6)。研究結(jié)果顯示,因素A和B具有顯著影響(P<0.05),因素C無顯著影響(P>0.05)(見表7)。

      3 討論

      廣玉蘭果實中的有效成分為聯(lián)苯型新木脂素類化合物,雙和厚樸酚A顯示出一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力[8]。有研究[10-12]報道,厚樸酚(magnolol)、和厚樸酚(honokiol)及和厚樸新酚(obovatol)等新木脂素類化合物具有多種顯著的生物學(xué)活性,如抗腫瘤、抗病毒、抗血小板、抗炎等。因此,本研究選取新木脂素類化合物雙和厚樸酚A為指標(biāo)成分,采用正交試驗進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化。參考藥用植物中活性成分的含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)[3,13-15],本研究采用反相高效液相色譜法測定了正交設(shè)計提取獲得的樣品,具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

      表6 L9(34)正交試驗設(shè)計

      表7 正交試驗方差分析表

      本研究通過不同溶媒提取比較、溶劑濃度、溶劑體積、提取時間等因素的考察,確立正交試驗因素計劃表,并用正交設(shè)計試驗進(jìn)行篩選得到了最佳提取工藝為正己烷作為提取溶媒、料液比為1∶30、浸泡時間為48 h、提取次數(shù)為3次,在該試驗條件的確定下同時進(jìn)行了穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗,證明該提取方法切實可行。但是,在提取過程中也嘗試了其他的溶媒提取(如甲醇、乙醇),發(fā)現(xiàn)提取后雙和厚樸酚A發(fā)生降解并且提取效率低下,其可能與雙和厚樸酚A在極性大的溶劑中的穩(wěn)定性相關(guān)。

      本研究首次通過正交設(shè)計試驗對廣玉蘭果實中雙和厚樸酚A的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,其方法簡單可行、合理、穩(wěn)定性好。

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