擬南芥中高效創(chuàng)制不攜帶轉(zhuǎn)基因元件多重突變體的CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)

在植物基因編輯的過(guò)程中去除CRISPR/Cas9 表達(dá)元件非常重要，因?yàn)镃RISPR/Cas9 表達(dá)元件在植物中的存在會(huì)帶來(lái)多方面的問(wèn)題：（1）取部分組織進(jìn)行基因型檢測(cè)時(shí)很難區(qū)分突變是遺傳自上一代還是當(dāng)代新產(chǎn)生的（當(dāng)代新產(chǎn)生的體細(xì)胞突變可能不能遺傳）；（2）CRISPR/Cas9 元件的持續(xù)存在既增加了脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，又不利于開(kāi)展后續(xù)的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)；（3）攜帶CRISPR/Cas9元件的植物屬于轉(zhuǎn)基因植物，獲得商業(yè)應(yīng)用的難度大大增加。

近日，北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院與生命科學(xué)學(xué)院陳浩東研究組在aBIOTECH 期刊發(fā)表了題為“A novel CRISPR/Cas9 system for efficiently generating Cas9-free multiplex mutants inArabidopsis”的研究論文，報(bào)道了一種高效地在擬南芥中創(chuàng)制多基因編輯的不攜帶轉(zhuǎn)基因元件（Cas9-free）植株的方法，該方法也可能在其他植物中類(lèi)似應(yīng)用。

研究者構(gòu)建了Cas9-P2A-GFP 融合蛋白，其中P2A 是可以發(fā)生自我斷裂的小肽，這樣GFP 不影響Cas9 的核酸內(nèi)切酶活性。結(jié)合同尾酶介導(dǎo)的串聯(lián)多個(gè)sgRNA 的技術(shù)，該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)多基因編輯。因GFP 與Cas9 的等量表達(dá)，通過(guò)觀測(cè)GFP 的熒光，即可獲得Cas9 蛋白的存在與否及含量高低的信息，而Cas9 蛋白的含量高低與基因編輯的效率具有很好的正相關(guān)性。由此，使用者在T1 代中挑選GFP 熒光強(qiáng)的植株，這些植株有很高的概率發(fā)生基因編輯，對(duì)目標(biāo)序列鑒定確認(rèn)發(fā)生編輯后，收集這些植株的T2 代種子；在T2 植株中挑選沒(méi)有GFP 表達(dá)的植株，即為目標(biāo)Cas9-free 植株。因 T1 代熒光弱的植株可直接舍棄，T2 代直接挑選無(wú)熒光的植株，大大減少了基因型鑒定的工作量，提高了研究效率。