質(zhì)譜技術(shù)在宮頸癌診斷中的應用及研究進展

孫克娜 綜述，劉曉斐 審校

1.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，山東濰坊261053；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六醫(yī)院實驗診斷科，山東濟南250031

宮頸癌（cervical cancer，CC）在女性生殖道惡性腫瘤中居于首位，在女性主要死亡原因中居第四位[1-2]。2018 年的調(diào)查表明我國是宮頸癌發(fā)生的高危國家[1]，面臨著較重的宮頸癌診治負擔。目前宮頸癌的篩查手段主要有液基薄層細胞學檢測（thinprep cytologic test，TCT）、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA 檢測、陰道鏡檢查和宮頸活檢。臨床主要應用鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）作為篩查宮頸癌的血清腫瘤標志物，它在晚期及復發(fā)的患者血清中升高明顯，但在早期患者血清中無明顯升高。早期診斷、及時和恰當?shù)闹委熆擅黠@提高宮頸癌的治愈率，降低病死率。因此，急需尋找敏感而有效的早期診斷宮頸癌方法。

蛋白質(zhì)組學作為一種新型的研究方法，可以動態(tài)、整體、定量觀察疾病發(fā)生發(fā)展中蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量的改變，有助于研究者們尋找腫瘤早期診斷和預后的特異性標志物以及藥物治療靶標。但是，蛋白質(zhì)組學作為一個完整系統(tǒng)，其特性和活動在很大程度上仍然難以解釋。目前，先進的質(zhì)譜技術(shù)讓我們對蛋白質(zhì)組學有了前所未有的認識，包括組成、結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控，同時，也為復雜的生物學過程和表現(xiàn)提供了理論依據(jù)[3]。

1 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix- assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子。電離過程是將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子中得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程，離子質(zhì)荷比與其飛行時間成正比[4]。它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的檢測。MALDI-TOF-MS 對分析物溶液中的鹽和洗滌劑有很高的耐受性[5]，可用于分析各種來源的小型有機或大型生化化合物[6]，已被證明是一種有價值的癌癥診斷工具。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，MALDI-TOF-MS 具有準確度高、檢測范圍廣、兼容性好等優(yōu)點，可以與熒光雙向電泳、磁珠等技術(shù)結(jié)合使用[7]。缺點主要是需要預處理、再現(xiàn)性差、信噪比和靈敏度低[8]；在檢測血清樣品時，受樣品基質(zhì)的干擾較為嚴重，尤其是相對分子質(zhì)量低于500 的小分子多肽。

在MALDI-TOF-MS 基礎(chǔ)上發(fā)展的可視化基質(zhì)輔助激光解析吸附質(zhì)譜分析成像（MALDIMSI）可將多種類型的化合物直接可視化和繪制到基質(zhì)涂層組織切片上。該技術(shù)具有客觀、準確、快速和所需標本量少等優(yōu)點。除蛋白質(zhì)和多肽外，MALDI-MSI 還可用于其他多種類型分子的研究[9]，以發(fā)現(xiàn)新的診斷相關(guān)生物標志物，特別是在腫瘤學研究領(lǐng)域[10-11]，有助于深入了解細胞癌變的機制[12]。以9-氨基吖啶為基質(zhì)的MALDI 可直接檢測癌組織中的蛋白質(zhì)、低質(zhì)量代謝物和脂質(zhì)，包括乳酸、丙酮酸、琥珀酸和富馬酸，其組織積累與特定綜合征代謝物相關(guān)。通過蛋白質(zhì)組學和代謝組學數(shù)據(jù)庫中的途徑信息，可以鑒定出具有與已知腫瘤生物學一致的不同代謝特征的腫瘤組織樣品內(nèi)的區(qū)域[11]。此外，Longuespée[13]強調(diào)基于LC-MS/MS 發(fā)現(xiàn)生物標記物數(shù)據(jù)的潛力，可以更好地指導MALDI 成像物質(zhì)的識別。

1.1 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌診斷中的應用

MALDI-TOF-MS 是近年來宮頸癌蛋白質(zhì)組學研究最為熱門的質(zhì)譜技術(shù)，已取得了突破性進展。在宮頸腺癌組織中篩選出3 個低表達（抑制素、PTEN、乳鐵蛋白）和4 個高表達（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、HIPK2、CD44、半乳凝集素7）的差異蛋白質(zhì)，Western 印跡結(jié)果（抑制素和PTEN 的表達變化情況）與蛋白質(zhì)組學結(jié)果相一致[14]。在宮頸鱗癌組織中發(fā)現(xiàn)mimecan、主動脈平滑肌肌動蛋白和lumican 表達增加，而角蛋白、Ⅱ型細胞骨架5、過氧化物酶1 和14-3-3 蛋白表達水平明顯降低[15]。這2 項研究分別針對宮頸腺癌和鱗癌，這些差異表達蛋白可能是宮頸癌發(fā)生的相關(guān)蛋白，可以作為宮頸癌早期診斷的潛在標志物，這也充分說明MALDI-TOF-MS 技術(shù)在癌癥患者活體組織中發(fā)現(xiàn)異常蛋白具有實驗可行性。組織學標志物研究可以為病理診斷提供分子依據(jù)，減少人為因素的干擾，能夠更好地區(qū)分癌組織和癌旁組織。

1.2 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展機制研究中的應用

近幾年，很多國內(nèi)外學者熱衷于信號傳導通路研究領(lǐng)域，致力于分析宮頸癌發(fā)生和發(fā)展機制。Pappa 等[16]通過雙向電泳對正常宮頸細胞（HCK1T）和HPV 陰性（C33A）、SiHa（HPV16+）、HeLa（HPV18+）宮頸癌細胞的蛋白進行分離，經(jīng)MALDI-TOF-MS 篩選出113 種差異表達的蛋白質(zhì)。生物信息學分析顯示，肌動蛋白的細胞骨架信號通路明顯失調(diào)，并且通過免疫印跡進一步驗證了肌動蛋白絲切蛋白1（cofilin-1）在C33A 和HeLa 細胞中顯著上調(diào)。絲切蛋白1 具有核定位信號，可以對肌動蛋白進行切斷和解聚，在肌動蛋白動力學中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項研究首次發(fā)現(xiàn)了絲切蛋白1 與宮頸癌的發(fā)生機制有關(guān)，為宮頸癌細胞骨架信號通路的研究提供了新的思路。Kontostathi 等[17]為了研究宮頸癌細胞系分泌蛋白在癌癥發(fā)生中的作用，采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β誘導的蛋白質(zhì)ig-h3（βig-h3）和過氧化物酶2（PRDX2）在宮頸癌細胞系中的表達顯著增加。這項研究與之前Monge 等[18]報道的轉(zhuǎn)化生長因子β與子宮癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的研究結(jié)果相一致。Kontostathi 等進一步采用生物信息學方法，發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞系中轉(zhuǎn)錄因子NRF2 是表達差異蛋白的調(diào)節(jié)因子。為了驗證這一生物信息學預測，采用免疫印跡和多重反應監(jiān)測（MRM）方法檢測了NRF2 的表達水平，發(fā)現(xiàn)與HCK1T 相比，NRF2 在SiHa 和C33A 細胞中表達上調(diào)。需要指出的是，異常的NRF2 介導的氧化應激反應（OSR）是癌癥發(fā)生的一個顯著特征[19]。作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NRF2 可以保護人體細胞免受氧化損傷，但NRF2 介導的氧化反應也是調(diào)節(jié)宮頸癌細胞系分泌蛋白的重要途徑。該實驗為后續(xù)開展宮頸癌研究提供了新途徑，致力于發(fā)現(xiàn)該途徑蛋白質(zhì)之間的相互作用，將為理想標志物的篩選和機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1.3 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌治療研究中的應用

最近，在HeLa 和侵襲性HeLa-15 細胞中發(fā)現(xiàn)孕酮受體膜組分1（PGRMC1）能夠調(diào)控宮頸癌細胞的進展和轉(zhuǎn)移，是宮頸癌潛在的治療靶點[20]。Chen 等[21]在手術(shù)預后研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)酮酶（TKT）和纖維蛋白原α鏈前體（FGA）是評估CC 患者手術(shù)預后的血清標志物。迄今，在宮頸癌治療過程中能夠用于臨床的標志物非常少，因此臨床應用價值還須進一步探討。宮頸鱗癌新輔助化療（NAC）在縮小腫瘤、控制微轉(zhuǎn)移、減少陽性淋巴結(jié)的數(shù)量和選擇手術(shù)方面具有重要意義。但是，在治療過程中，宮頸癌患者對大部分化學治療劑具有抵抗性，降低了該療法的有效性。Guo 等[22]為了尋找SCC 患者對NAC 反應的預測標志物，采用二維凝膠電泳對接受NAC 的宮頸鱗癌患者的癌灶蛋白進行分離，將差異表達的12 個蛋白點通過MALDI-TOF 進行檢測。NAC 無應答者與NAC響應者相比，7 個蛋白質(zhì)點上調(diào)，5 個蛋白質(zhì)點下調(diào)。這些蛋白質(zhì)參與細胞代謝、遷移和凋亡信號轉(zhuǎn)導等多種細胞過程。最后，通過免疫印跡鑒定了3 個蛋白，驛蛋白1（stathmin1）、Hsp70 和丙酮酸激酶同種型M2，并且發(fā)現(xiàn)Hsp70 的過表達有抑制順鉑的效果。該研究發(fā)現(xiàn)了許多候選蛋白質(zhì)參與化療耐藥/敏感性的調(diào)控，其中Hsp70 可能是預測宮頸鱗癌患者化療療效的潛在標志物。

2 表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜

2002 年，田中耕一發(fā)明了表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），由蛋白質(zhì)芯片、激光吸收離子化質(zhì)譜設(shè)備和人工智能數(shù)據(jù)分析處理軟件三部分組成，其檢測原理是利用激光脈沖輻射使芯片表面結(jié)合能量，吸收分子的分析物，解析成帶電離子，質(zhì)荷比不同的離子在磁場中飛行時間不同，經(jīng)計算機軟件處理后形成模擬圖譜。質(zhì)譜圖和離子流圖相結(jié)合可直觀顯示獲得的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、含量、等電點、磷酸化位點、糖基化位點等信息。SELDI-TOF-MS 應用簡便，高通量，自動化，能夠不經(jīng)處理直接點樣檢測標本中的多種蛋白質(zhì)。但它對高分子量蛋白質(zhì)不敏感，僅限于對低分子量肽的分析[23]。隨著標準檢測條件和蛋白資料庫的不斷完善，再結(jié)合基因組積累的大量信息，相信SELDI-TOF-MS 必將成為臨床常規(guī)診斷和基礎(chǔ)理論研究的重要技術(shù)手段。

2.1 SELDI-TOF-MS 在宮頸癌診斷中的應用

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學研究的不斷深入，運用SELDI-TOF-MS 技術(shù)檢測宮頸癌患者的特異多肽標志物，為宮頸癌的診斷、治療效果及預后復發(fā)的評估提供了新的思路。梁衛(wèi)江等[24]采用SELDI-TOF-MS 研究宮頸鱗癌患者血清差異蛋白質(zhì)與SCCA 之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)m/z4172、3397、2741和6086 在宮頸鱗癌SCCA 正常組和升高不同水平組中反復出現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)可作為宮頸癌早期標志物進行深入研究，具有重要的臨床應用前景和研究價值。SELDI-TOF-MS 樣品來源廣泛，血液、尿液和組織液等均可作為檢測對象。在血清標本中，蔡思娜等[25]采用SELDI-TOF-MS 結(jié)合弱陽離子磁珠檢測了25 例健康女性志愿者和24 例SCCA 正常的宮頸癌患者血清，篩選出4 個顯著性差異的多肽峰。通過建立聯(lián)合診斷數(shù)據(jù)模型進行分析，發(fā)現(xiàn)其診斷宮頸癌的敏感性和特異性分別為91.67%、96%，達到了比較理想的結(jié)果。在尿液標本中，Mu 等[23]通過SELDI-TOF-MS 對比經(jīng)木菠蘿甘露糖結(jié)合（champedak mannose binding，CMB）凝集素捕獲宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和健康者的尿糖肽，發(fā)現(xiàn)m/z1201 能將卵巢癌與宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌區(qū)別開來，敏感性和特異性均為100%，而m/z1449 能將子宮內(nèi)膜癌與其他2 種癌癥區(qū)分開。尿糖肽m/z1201 和1449 可作為早期診斷宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的潛在生物標志物。這些研究證明了SELDI-TOF-MS 在臨床診斷方面的優(yōu)勢及其可行性。但目前大多數(shù)研究標本量較少，需要增加標本量做進一步的驗證。

2.2 SELDI-TOF-MS 在宮頸癌治療研究中的應用

在宮頸癌治療過程中通過SELDI-TOF-MS 分析，證實SCCA 可以用來判斷臨床分期和指導臨床手術(shù)[26]。SCCA 的臨床應用不再局限于篩選宮頸癌患者和評估化療療效，可以有效地避免TCT和病理診斷取材的限制，月經(jīng)經(jīng)期也可以進行檢測，減少了診斷時間，提高了患者的生存周期。另外，Van 發(fā)現(xiàn)m/z2698.9、3953.2 和15254.8 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。放化療是治療晚期宮頸癌的一個主要手段，在評估治療效果的研究中，Harima等[28]通過SELDI-TOF-MS 對評估良好的宮頸癌患者和已死亡宮頸癌患者的2 組血清與健康體檢者的血清分別進行比較，篩選出m/z8918（已死亡患者明顯低于對照組和評估良好的患者），然后采用肽質(zhì)量指紋圖譜和串聯(lián)質(zhì)譜方法鑒定出與該肽峰最匹配的蛋白是載脂蛋白CⅡ（ApoC-Ⅱ），并通過ELISA 進一步驗證和確認。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，參與細胞增殖、分化、血管生成和細胞遷移。ApoC-Ⅱ作為MMP 的新型底物，對宮頸癌進展的調(diào)控具有重要作用。

3 結(jié)語

雖然SELDI-TOF-MS 和MALDI-TOF-MS 功能強大，可用于篩選新型生物標志物，但也面臨著一系列的難題。例如，質(zhì)譜儀價格昂貴，對操作人員的要求高，使該項技術(shù)很難在基層開展。最重要的問題是，要簡化蛋白質(zhì)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測的步驟，滿足高通量蛋白質(zhì)組學研究的需要。另外，目前腫瘤標志物的研究樣本量較少，不能對各個年齡、各個民族進行充分驗證，還需要深入研究。蛋白質(zhì)圖譜揭示了基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達、蛋白質(zhì)的修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。隨著質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學的不斷發(fā)展，我們可以對尿液、血清、組織等多種類型標本的蛋白質(zhì)組學進行分析，獲得更多的生物學信息。我們還可以通過生物信息學技術(shù)不斷完善蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，進而分析癌癥患者發(fā)生癌變的機制和關(guān)鍵步驟，探索出有針對性的預防和治療方案，為疾病的早期診斷和預后判斷提供有效的手段。