人參皂苷Rh1對(duì)AD小鼠認(rèn)知障礙的改善作用

畢云楓,陶偉明,王溪竹,李彤昕,閆 璐,孫 航,鄭明珠,劉景圣

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease,AD)又稱老年癡呆,屬于退行性疾病的一種,此病以認(rèn)知功能障礙和記憶力減退為主要特征,是目前死亡率最高的四大疾病之一,預(yù)計(jì)到2050年,全世界85人中將有1人患有此病[1-3]。阿爾茨海默癥早期階段的表現(xiàn)為輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment,MCI)[4-5],該病起病隱匿,病程較長(zhǎng)[6],且MCI轉(zhuǎn)為AD的危險(xiǎn)性比正常人群高10倍,若能盡早發(fā)現(xiàn)并干預(yù),可以減輕患者癥狀,延緩病情發(fā)展[7]。認(rèn)知功能下降主要與膽堿能神經(jīng)傳遞完整性降低有關(guān)。由于東莨菪堿誘導(dǎo)的遺忘癥是由膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)阻滯引起的,因此它被用于模擬AD相關(guān)的認(rèn)知缺陷[8-9]。乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)是一種神經(jīng)遞質(zhì),屬于中樞膽堿能系統(tǒng),在記憶調(diào)節(jié)中起著重要作用[10]。東莨菪堿是毒蕈堿拮抗劑,誘導(dǎo)中樞膽堿能阻滯,并可在記憶維持中產(chǎn)生可逆損傷可用于AD建模[11]。

人參指五加科植物人參的干燥根和根莖,在世界范圍內(nèi)用于預(yù)防各種疾病,包括抗疲勞、抗壓力、免疫調(diào)節(jié)、抗癌癥等[12-13]。商崇智等[14]發(fā)現(xiàn)Rg2能改善東莨菪堿誘導(dǎo)的AD小鼠的記憶;Gong等[15]研究人參皂苷Rg2能顯著改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙;張敏等[16]報(bào)道了人參皂苷Rg2可以減輕大鼠海馬神經(jīng)元的損傷,從而提高學(xué)習(xí)記憶能力。人參皂苷Re、Rg1、Rg2是主要的三醇組天然皂苷,但是隨著人參皂苷生物降解技術(shù)的發(fā)展,人參皂苷Re、Rg1、Rg2均可被降解為人參皂苷Rh1[17-18]。人參皂苷Rh1在C-6鍵上比Rg2少一個(gè)鼠李糖糖苷鍵,其結(jié)構(gòu)如圖1所示[19]。已有研究證實(shí),人參皂苷Rh1具有抗癌、抗腫瘤、治療皮膚疾病、提高免疫力等功效[20-23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)Rh1對(duì)行為測(cè)試和電生理學(xué)研究中的記憶障礙和海馬興奮性均有改善作用,但國(guó)內(nèi)外對(duì)人參皂苷Rh1改善認(rèn)知障礙的研究尚少。

圖1 人參皂苷Rh1結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of ginsenoside Rh1

因此,本文向雄性昆明小鼠腹腔注射東莨菪堿建立AD模型,以石杉?jí)A甲作為陽(yáng)性對(duì)照組,研究人參皂苷Rh1對(duì)模型小鼠輕度認(rèn)知障礙的改善作用,為其開發(fā)成為延緩AD藥物作參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 40只,雄性,6周齡,22～30 g,合格證編號(hào):SCXK(吉2017-0005),長(zhǎng)春市生物制品研究所有限責(zé)任公司;人參皂苷Rh1(純度>98%) 北京英納澤信化工技術(shù)研究所;氫溴酸東莨菪堿 山西玉寧生物公司;石杉?jí)A甲 批號(hào)H10960133,上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司;乙酰膽堿測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

ZH-800S跳臺(tái)儀 淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;BA-200小鼠避暗儀 成都泰盟科技有限公司;WMT-100S Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng) 成都泰盟軟件有限公司;SynergyTM2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司;Neofuge 23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將小鼠放在室溫(22±1) ℃,濕度50%±5%環(huán)境下,12 h光暗周期(08:00 am～08:00 pm)適應(yīng)5 d。小鼠被隨機(jī)分成6組(n=30),每組6只?？瞻捉M:灌胃10 mL/kg等劑量生理鹽水;陰性對(duì)照組:灌胃10 mL/kg等劑量生理鹽水;陽(yáng)性對(duì)照組:灌胃66.7 μg/kg的石杉?jí)A甲;人參皂苷Rh1低劑量組:灌胃5 mg/kg;人參皂苷 Rh1中劑量組:灌胃10 mg/kg;人參皂苷Rh1高劑量組:灌胃15 mg/kg。每天灌胃相應(yīng)藥物共4周。除空白組外,其他實(shí)驗(yàn)組每天(07:00 am～08:00 am)腹腔注射1 mg/kg的東莨菪堿,建立認(rèn)知障礙模型。4周之后進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn),試驗(yàn)前1 h給予相應(yīng)藥物,30 min之后腹腔注射1 mg/kg東莨菪堿[25]。

1.2.2 避暗試驗(yàn) 潛伏期為每只小鼠從放入明室開始到第一次進(jìn)入暗室后所遭電擊的時(shí)間。由于小鼠是夜間行進(jìn)動(dòng)物,本能會(huì)逃向暗處,在暗室以電擊刺激來(lái)訓(xùn)練小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。訓(xùn)練階段:將每只小鼠放入明室,5 s后將門升起,一旦動(dòng)物完全進(jìn)入暗室(所有爪子),立即關(guān)閉門,并且將32 V不可避免的電擊傳遞給小鼠的腳2 s。然后將小鼠移至明室,5 min后重復(fù)該過(guò)程。當(dāng)小鼠連續(xù)5 min停留在光照室時(shí),訓(xùn)練結(jié)束。24 h后進(jìn)行測(cè)驗(yàn),記錄每只小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期和5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)。停止訓(xùn)練5 d后進(jìn)行消退試驗(yàn)[26]。

1.2.3 跳臺(tái)試驗(yàn) 跳臺(tái)試驗(yàn)是一種普遍的對(duì)小鼠在藥物和其他干預(yù)措施之后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估的方法。試驗(yàn)時(shí),小鼠放在箱內(nèi)的絕緣平臺(tái)上到第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間被稱為潛伏期。訓(xùn)練階段:將小鼠預(yù)先放入暗箱中適應(yīng)3 min后,立即用32 V交流電刺激,然后將小鼠放在平臺(tái)上適應(yīng)一段時(shí)間。測(cè)驗(yàn)階段:24 h后進(jìn)行測(cè)驗(yàn),將小鼠放置在平臺(tái)上后開始計(jì)時(shí),記錄潛伏期和5 min內(nèi)的跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)。停止訓(xùn)練5 d后進(jìn)行消退試驗(yàn)[27]。

1.2.4 Morris水迷宮試驗(yàn) 此實(shí)驗(yàn)是根據(jù)小鼠在水中有逃避水源的本能,并且會(huì)以最快的途徑逃出水源,學(xué)會(huì)逃避水源的過(guò)程體現(xiàn)小鼠的記憶力能力。此次試驗(yàn)訓(xùn)練階段為其5 d。將游泳池分為4個(gè)象限,將一個(gè)白色的逃生平臺(tái)放在水面以下0.5 cm并位于第2象限處,平臺(tái)的位置在實(shí)驗(yàn)期間是固定的[28]。整個(gè)試驗(yàn)期間水溫保持在(30±1) ℃,并在30 cm深的水里加入500 mL牛奶。訓(xùn)練階段:第1 d,將小鼠放在平臺(tái)附近,允許其自行爬上3次,停留30 s后在下一象限繼續(xù)訓(xùn)練。如果小鼠在90 s內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái),則將其引至平臺(tái)并在平臺(tái)上停留30 s,然后在下一象限進(jìn)行訓(xùn)練。之后的4 d訓(xùn)練,每次都先將小鼠放在平臺(tái)附近,使其自行爬上1次,以進(jìn)一步確定訓(xùn)練結(jié)果。

表1 人參皂苷對(duì)小鼠避暗試驗(yàn)的影響Table 1 Effects of ginsenosides on passive avoidance test in

注:陰性組與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與陰性組比較,*P<0.05,**P<0.01;表2,圖2～圖3、圖5同。

表2 人參皂苷對(duì)小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響Table 2 Effects of ginsenosides on step-down avoidance test in

24 h后進(jìn)行最后測(cè)驗(yàn)。記錄60 s內(nèi)每只小鼠爬上平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間以及小鼠的游泳路徑。動(dòng)物行為由攝像機(jī)記錄并通過(guò)特定軟件分析[29]。

1.2.5 腦海馬體中乙酰膽堿含量測(cè)定 Morris水迷宮試驗(yàn)完成后,按照Sultan[30]的方法立即將小鼠脫頸椎處死,然后在冰上解剖小鼠腦海馬體,存放于100%甲醇中勻漿脫蛋白。將勻漿離心(15000×g,4 ℃)10 min,并保存上清液[31],使用試劑盒測(cè)定Ach水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析使用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定P<0.05或P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷Rh1對(duì)小鼠避暗試驗(yàn)的影響

如表1所示,與空白組相比,陰性對(duì)照組測(cè)驗(yàn)潛伏期與測(cè)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)都極顯著高于空白組(P<0.01),說(shuō)明造模有效。藥物治療后,Rh1低、中劑量組消退試驗(yàn)潛伏期接近空白組;與陰性對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組、Rh1低劑量組消退試驗(yàn)潛伏期顯著增加(P<0.05),Rh1中劑量組極顯著提高(P<0.01)。與陰性對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和Rh1中劑量組的消退試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05),且Rh1中劑量組略優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。在避暗試驗(yàn)中,Rh1高劑量組對(duì)小鼠認(rèn)知障礙的改善效果并不明顯。

2.2 人參皂苷Rh1對(duì)小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

如表2所示,與空白組比較,陰性對(duì)照組跳臺(tái)測(cè)驗(yàn)潛伏期極顯著(P<0.01)縮短,測(cè)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)極顯著(P<0.01)增加,說(shuō)明造模是有效的。陽(yáng)性對(duì)照組和Rh1低、中劑量組與陰性對(duì)照組相比,消退試驗(yàn)潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01);Rh1三個(gè)劑量組的消退試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)也明顯減少(低、高劑量組P<0.05,中劑量組P<0.01)。Rh1中劑量組的療效與陽(yáng)性對(duì)照組相近。

2.3 人參皂苷Rh1對(duì)小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)的影響

從圖2可知,陰性對(duì)照組與空白組相比,找到平臺(tái)的時(shí)間極顯著增加(P<0.01),說(shuō)明其學(xué)習(xí)記憶能力明顯衰退。與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較,Rh1低、高劑量組找到平臺(tái)的時(shí)間顯著縮短(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組和Rh1中劑量組極顯著降低(P<0.01),且這兩組小鼠的游泳速度明顯快于陰性對(duì)照組(P<0.05，圖3)。圖4為部分小鼠的游泳路徑,空白組的小鼠可以快速且直接的找到平臺(tái);陰性對(duì)照組的小鼠直到60 s結(jié)束仍未找到平臺(tái);陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠最初游到泳池的第4象限,但很快找到位于第2象限的平臺(tái);Rh1中劑量組的小鼠游泳路徑與陽(yáng)性對(duì)照組相似,但在第4象限停留時(shí)間稍長(zhǎng);Rh1低、高劑量組的小鼠也可在60 s之內(nèi)找到平臺(tái),但比中劑量組的游泳路線更復(fù)雜。Rh1中劑量組游泳速度以及找到平臺(tái)的時(shí)間幾乎接近陽(yáng)性對(duì)照組,意味著Rh1中劑量組最接近石杉?jí)A甲的藥效。

圖2 人參皂苷對(duì)小鼠水迷宮試驗(yàn)的影響Fig.2 Effects of ginsenosides on Morris water maze test in

圖3 人參皂苷對(duì)小鼠游泳速度的影響Fig.3 Effects of ginsenosides on

圖4 水迷宮試驗(yàn)中各組小鼠的游泳路徑Fig.4 Representation of swimming paths during the Morris water maze test of mice注:a：空白組;b：陰性對(duì)照組;c：陽(yáng)性對(duì)照組; d：Rh1-低;e：Rh1-中;f：Rh1-高。

圖5 人參皂苷對(duì)小鼠腦海馬體中 Ach含量的影響Fig.5 Effect of ginsenosides on Ach

2.4 人參皂苷Rh1對(duì)小鼠腦海馬體中Ach含量的影響

從圖5可以看出,東莨菪堿的干預(yù)降低了小鼠腦海馬體中Ach含量,而經(jīng)過(guò)藥物治療之后,又可以顯著提高其含量(P<0.05)。其中,陽(yáng)性對(duì)照組、Rh1低、中劑量組與陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái),AD也逐漸成為了越來(lái)越嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題[32]。目前仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療途徑能從根本上防治AD。人參皂苷作為人參的有效活性成分之一,具有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用,能夠有效防治AD[33]。崔婧[33]研究表明,人參皂苷Rg2可以抑制Aβ25-35導(dǎo)致的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化,從而達(dá)到抗阿爾茨海默病的作用。而Rh1作為Rg2的主要代謝產(chǎn)物,是否具有調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)能力的藥理活性,其作用機(jī)制與Rg2是否相同,成為本研究關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究結(jié)果提示,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)中模型組小鼠潛伏期極顯著(P<0.01)延長(zhǎng)、測(cè)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)多、有效區(qū)域游泳時(shí)間和路程長(zhǎng),說(shuō)明模型組小鼠存在嚴(yán)重的認(rèn)知障礙。給予人參皂苷Rh1后,小鼠逃避潛伏期顯著(P<0.05)縮短、消退試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少、有效區(qū)域滯留時(shí)間和路程縮短、其空間辨別行為障礙顯著(P<0.05)改善,說(shuō)明人參皂苷Rh1可對(duì)小鼠的認(rèn)知能力有顯著(P<0.05)改善,對(duì)腦海馬體中Ach含量具有一定提高作用。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,即使Rh1低劑量組,改善記憶的作用仍然明顯。在高劑量組,可能由于濃度過(guò)高(15 mg/kg),故其改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶的作用沒(méi)有中劑量組明顯,原因有待進(jìn)一步深入研究。Rh1中劑量的藥效更有助于小鼠改善記憶,由此確定Rh1中劑量(10 mg/kg)改善小鼠認(rèn)知障礙的效果最好,且效果與石杉?jí)A甲相當(dāng)。

綜上所述,人參皂苷Rh1可以明顯提高AD模型小鼠海馬體中乙酰膽堿含量,為人參皂苷Rh1應(yīng)用于AD的臨床治療提供了重要依據(jù)。