激酶LMTK3在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義①

泮紅飛 羅軍敏 楊濤羽 蘇 俊 張 紅 龍潤(rùn)瑩 馮繼紅

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563000)

前列腺癌(prostate cancer,pCa)是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率升至男性惡性腫瘤第二位[1,2]。雖然我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率、死亡率均低于世界平均水平，但近年顯著增長(zhǎng)且呈年輕化趨勢(shì)[3]。LMTK3是絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶家族(Serine-threonine-tyrosine kinase family)的重要成員，在乳腺癌[4]、甲狀腺癌[5]、肺癌[6]、胃癌[7]、結(jié)直腸癌[8]及慢性中性粒細(xì)胞白血病(Chronic neutrophilic leukemia，CNL)[9]等多種惡性腫瘤組織中均高表達(dá)，提示LMTK3可能在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但Sun等[10]報(bào)道LMTK3在前列腺癌組織中低表達(dá)，在體外能抑制前列腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，參與非ER信號(hào)途徑。而近年來(lái)，雌激素對(duì)前列腺癌的作用越來(lái)越受到重視，雌激素在前列腺癌中主要通過(guò)雌激素受體(Estrogen receptor,ER)發(fā)揮作用，目前對(duì)ERα的研究較多，但對(duì)其表達(dá)部位和作用的研究尚有爭(zhēng)議。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)方法檢測(cè)前列腺癌及前列腺增生組織中LMTK3和ERα的表達(dá)情況，分析其與臨床病理資料的關(guān)系及二者表達(dá)量間的相關(guān)性，初步探究LMTK3在前列腺癌進(jìn)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

1.1.1材料來(lái)源 收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月～2016年7月經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢并經(jīng)病理首次確診的55例前列腺癌組織標(biāo)本和25例前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)組織標(biāo)本，術(shù)前均未行放化療和內(nèi)分泌治療。患者年齡42～89歲，平均(71.18±8.56)歲，其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；按照Gleason評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的病理分級(jí)[11]：高分化癌2例，中分化癌15例，低分化癌38例；按照Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行的臨床分期：1+2期25例，3+4期30例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋后行3 μm厚連續(xù)切片，做免疫組化染色。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.2主要試劑和儀器 LMTK3兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Lifespan公司；ERα兔抗人多克隆抗體購(gòu)自 Abcam公司；PV-9000免疫組化試劑盒(HRP標(biāo)記，不需稀釋)、濃縮型DAB試劑和蘇木素染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀(1235-auto-DELFIA)和TPSA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總前列腺特異性抗原(Total prostate specific antigen,TPSA)的檢測(cè)方法 空腹抽血3 ml，離心，取血清于2 h內(nèi)采用高靈敏度的時(shí)間分辨熒光免疫分析(TrFIA)雙標(biāo)法測(cè)定TPSA的含量。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、檸檬酸鹽抗原修復(fù)后，3%過(guò)氧化氫(PV-9000免疫組化試劑盒里的試劑①阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉后，分別滴加抗LMTK3的一抗(1∶100稀釋)和抗ERα的一抗(1∶100稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗(PV-9000免疫組化試劑盒里的試劑②和試劑③，室溫孵育1.5 h，DAB和蘇木素顯色，對(duì)比染色封片。用PBS液(pH=7.2～7.4)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 胞漿著黃色或棕褐色為L(zhǎng)MTK3蛋白染色陽(yáng)性。雙評(píng)半定量法進(jìn)行評(píng)分：(1)染色強(qiáng)度分四級(jí)：不著色者為0分，淺黃色者為1分，棕黃色者為2分，棕褐色者為3分；(2)著色細(xì)胞百分比分五級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例6%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例76%～100%為4分。兩種評(píng)分相加為最終得分，總分在0～1分表示陰性，2～3分表示弱陽(yáng)性，4～5分表示陽(yáng)性，6～7分表示強(qiáng)陽(yáng)性、陰性和弱陽(yáng)性代表LMTK3低表達(dá)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性代表LMTK3高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 免疫組織化學(xué)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法、Pearson和Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)方法測(cè)前列腺癌和前列腺增生組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.1.1免疫組織化學(xué)方法測(cè)前列腺癌和前列腺增生組織中LMTK3蛋白的表達(dá) LMTK3在前列腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且以在上皮細(xì)胞的表達(dá)為主。55例前列腺癌中LMTK3強(qiáng)陽(yáng)性9例，陽(yáng)性11例，弱陽(yáng)性3例，陰性32例；LMTK3陽(yáng)性病例占36.36%。而在25例良性前列腺增生組織中LMTK3強(qiáng)陽(yáng)性6例，陽(yáng)性10例，弱陽(yáng)性1例，陰性8例；LMTK3陽(yáng)性病例占64.00%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.304，P<0.05)(圖1、表1)。

2.1.2免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)前列腺癌和前列腺增生組織ERα蛋白表達(dá) ERα蛋白在前列腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且以在間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)為主。55例前列腺癌中ERα強(qiáng)陽(yáng)性5例，陽(yáng)性13例，弱陽(yáng)性2例，陰性35例；陽(yáng)性病例占32.73%。而在25例良性前列腺增生組織中ERα強(qiáng)陽(yáng)性7例，陽(yáng)性7例，弱陽(yáng)性1例，陰性10例；陽(yáng)性病例占56.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.879，P<0.05)(圖2、表2)。

2.2LMTK3、ERα在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理資料關(guān)系 LMTK3蛋白在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)水平與Gleason分級(jí)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，隨著年齡和TPSA含量的升高而降低，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性不強(qiáng)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)；ERα蛋白在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)水平與TPSA含量和Gleason分級(jí)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)相關(guān)性不強(qiáng)(P>0.05，表4)。

2.3LMTK3、ERα在前列腺癌和前列腺增生組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 采用Pearson和Spearman分析LMTK3與ERα蛋白在前列腺癌和前列腺增生組織中表達(dá)的相關(guān)性，分析結(jié)果如表5所示，二者呈正相關(guān)(r=0.296，P=0.024)。

圖1 LMTK3在前列腺癌和前列腺增生組織中的免疫組化(SP,×40)Fig.1 Immunohistochemical staining of LMTK3 in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues(SP,× 40)Note: A.Strong positive;B.Positive;C.Negative;D.Control;E.Strong positive;F.Positive;G.Negative;H.Control.

圖2 ERα在前列腺癌組織和前列腺增生組織中的免疫組化染色結(jié)果(SP，× 40)Fig.2 Immunohistochemical staining of LMTK3 in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues(SP,× 40)Note: A.Strong positive;B.Positive;C.Weak positive;D.Negative;E.Strong positive;F.Positive;G.Negative;H.Control

表1 LMTK3蛋白在前列腺癌及前列腺增生組織中的表達(dá)情況

表2 ERα蛋白在前列腺癌及前列腺增生組織中的表達(dá)情況

表3 LMTK3蛋白在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)及其與臨床資料相關(guān)性

表4 ERα蛋白在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)及其與臨床資料相關(guān)性

表5 LMTK3與ERα在前列腺癌與前列腺增生組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

目前，有關(guān)前列腺癌的研究還不足以充分闡明其發(fā)病機(jī)制。因此，從分子水平深入探究其癌變機(jī)制，尋找新型可靠的預(yù)防、診斷或治療前列腺癌的靶基因及其相關(guān)調(diào)控基因具有重要意義。由于前列腺癌并不發(fā)生于雄激素水平較高的青年，而發(fā)生于雄激素水平已經(jīng)下降的老年，提示雄激素不是導(dǎo)致前列腺疾病的唯一因素，而雌激素及其受體受到越來(lái)越多的關(guān)注[12]。

目前對(duì)于ERα在前列腺組織中的表達(dá)部位及其功能的研究尚存在爭(zhēng)議。Leav等[13]認(rèn)為ERα主要位于前列腺組織中的基底上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞；宋益挺等[14]發(fā)現(xiàn)ER在BPH組織中高表達(dá)，推測(cè)其可能促進(jìn)BPH的發(fā)生；先前研究證明ERα在正常前列腺組織中呈低表達(dá)，在BPH中高表達(dá)，而在pCa中表達(dá)下降(P<0.01)，在前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移區(qū)域無(wú)表達(dá)。與上述研究不同，以下研究卻得出不同的結(jié)論：覃展偶等[15]發(fā)現(xiàn)ERα主要在前列腺組織的間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，上皮細(xì)胞中無(wú)表達(dá)；檢測(cè)健康人群和BPH患者前列腺組織中ERα的表達(dá)，結(jié)果提示人BPH組織中ERα的表達(dá)顯著降低；現(xiàn)有研究報(bào)道報(bào)道在前列腺癌發(fā)展過(guò)程中，ERα的表達(dá)從基底細(xì)胞擴(kuò)展到腔細(xì)胞并且表達(dá)水平增加，ERα在低分化與轉(zhuǎn)移性前列腺癌中均高表達(dá)，認(rèn)為ERα可能參與了前列腺組織的癌變進(jìn)程[17-19]。

狐猴酪氨酸激酶家族的成員包括LMTK1、LMTK2和LMTK3，編碼人類(lèi)LMTK3的基因定位在19q13.33，是單次跨膜蛋白。LMTK3可通過(guò)催化ERα磷酸化參與多條細(xì)胞信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、分化、成瘤、耐藥和凋亡等病理生理過(guò)程中扮演重要角色。Stebbing等[4]認(rèn)為激酶與ERα之間的相互作用是人類(lèi)乳腺癌的關(guān)鍵信號(hào)通路。Mackiewicz等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過(guò)調(diào)節(jié)ER的活性抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)，而Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)LMTK3是miR-34a的靶點(diǎn)。Giamas等[22]認(rèn)為在乳腺癌中LMTK3是調(diào)控ERα最有效的因子。沉默LMTK3能激活PKC從而導(dǎo)致Akt的磷酸化、FOXO3的降解，進(jìn)而降低ERα的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)量。此外，LMTK3還能直接磷酸化ERα，在蛋白水平上保護(hù)它免受蛋白酶體的降解，且沉默LMTK3基因可抑制ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖和裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)。Stebbing等[23]證明LMTK3能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層面促進(jìn)他莫昔芬耐藥基因的表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)他莫昔芬的耐藥。綜上所述，LMTK3通過(guò)調(diào)節(jié)ERα的活性影響乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤性，參與乳腺癌內(nèi)分泌治療的耐藥過(guò)程。

Sun等[10]證明LMTK3在前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，與正常組織相比，LMTK3在前列腺癌中的表達(dá)水平明顯下降。LMTK3在體外能抑制PC3和LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)能誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡。且LMTK3能夠抑制AKT和ERK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)p38激酶和JNK激酶的磷酸化和激活。由于目前尚無(wú)LMTK3在pCa患者中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和ER間的相關(guān)性報(bào)道，因此，本研究以BPH作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LMTK3、ERα在前列腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)和ER間的相關(guān)性。結(jié)果顯示LMTK3、ERα在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于其在前列腺增生組織中的表達(dá)，二者的陽(yáng)性率隨著腫瘤Gleason分級(jí)的增高而明顯下調(diào)，且ERα與TPSA含量亦呈負(fù)相關(guān)性。另外，通過(guò)相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)LMTK3的表達(dá)量和ERα的表達(dá)量間存在正相關(guān)關(guān)系，提示LMTK3可能通過(guò)ERα參與前列腺癌的進(jìn)展。由此可見(jiàn)，LMTK3可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，并可能通過(guò)ERα參與前列腺癌的進(jìn)程，而LMTK3的低表達(dá)機(jī)制及參與前列腺癌進(jìn)程的機(jī)制還有待做進(jìn)一步的深入探索。

綜上所述，LMTK3在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于其在前列腺增生組織中的表達(dá)，且在前列腺組織中LMTK3與ERα的表達(dá)量存在正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)對(duì)前列腺癌組織中LMTK3表達(dá)水平的研究，有助于了解LMTK3的低表達(dá)機(jī)制及與前列腺癌進(jìn)程的關(guān)系，LMTK3也有望成為有潛在價(jià)值的前列腺癌干預(yù)靶點(diǎn)。