整合PD-L1單鏈抗體的融合蛋白制備及其抗腫瘤活性的驗(yàn)證①

談 燚 秦中強(qiáng) 周萬(wàn)飛 李紅俊 劉明珠 許文青 李正紅 李永海

(蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 233030)

關(guān)于癌癥的免疫治療策略，已經(jīng)從全身的、非特異性的模擬免疫系統(tǒng)發(fā)展到靶向性的活化免疫系統(tǒng)的某種特定部分。這種靶向性的治療最終結(jié)果會(huì)降低免疫治療的毒性并增加其療效[1]。免疫檢查點(diǎn)治療，靶向作用于T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)途徑以增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，已取得重要的臨床進(jìn)展，并為癌癥治療提供了新的武器。這種治療已經(jīng)表現(xiàn)出持久的臨床作用，并且在一小部分患者中，患者多年沒(méi)有出現(xiàn)癌癥的臨床癥狀，得到長(zhǎng)期緩解[2]。免疫治療已經(jīng)改變了一些類型腫瘤的治療策略，如黑素瘤，以及最近的非小細(xì)胞肺癌。惡性腫瘤的免疫逃逸是腫瘤形成和進(jìn)展所必需的，是癌癥的重要標(biāo)志。因此，近年來(lái)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的療法在治療惡性腫瘤方面取得了顯著的成功，尤其突出的是對(duì)免疫檢查點(diǎn)封鎖的治療方法，其是針對(duì)T細(xì)胞抑制受體或免疫檢查點(diǎn)的治療[3]。免疫檢查點(diǎn)對(duì)于維持自我耐受性至關(guān)重要，并且已知一些腫瘤利用免疫檢查點(diǎn)系統(tǒng)來(lái)逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)，例如針對(duì)程序性細(xì)胞死亡因子-1(PD-1/PD-L1)途徑的免疫檢查點(diǎn)封鎖治療晚期NSCLC，已經(jīng)作為單一療法或聯(lián)合治療，取得顯著的臨床益處[4]。

程序性死亡因子1(PD-1)及其配體(PD-L1)是一對(duì)免疫負(fù)性共刺激因子。PD-1及其配體PD-L1通路的活化在T細(xì)胞的免疫耐受并形成免疫抑制微環(huán)境中起到重要作用[5，6]。PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活，可以導(dǎo)致體內(nèi)T細(xì)胞“耗竭”，抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視和殺傷；而阻斷此信號(hào)通路，則可以逆轉(zhuǎn)其腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤效應(yīng)。靶向免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑如程序性細(xì)胞死亡1(PD-1)/PD-1配體1(PD-L1)已經(jīng)在各種癌癥中取得了顯著的益處，導(dǎo)致多種臨床針對(duì)其他相關(guān)B7/CD28家族成員的抗體試驗(yàn)[7，8]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 pFuse真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；A549(肺腺癌細(xì)胞)購(gòu)自合肥中科院；293F(人胚腎細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存；包含識(shí)別人PD-L1蛋白的單鏈抗體的核苷酸序列由上海生工合成；PCR引物序列一對(duì)：正向引物：5′-TCTTGCACTGTCACGAATTCGGAAGTGCAGCTGCTGGAA-TC-3′，反向引物：5′-GCGGCCGCAAGGTACCACAGCACGGTCACTTTGGTG-3′，由上海生工合成。Trans5a感受態(tài)：購(gòu)自全式金；限制性內(nèi)切酶： DPNⅠ內(nèi)切酶 KpnI-HF、EcoRI-HF，DNA 連接酶：Assembly Master Mix，購(gòu)自NEB公司；DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒；TIANGEN無(wú)內(nèi)毒素大提試劑盒；高糖DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染試劑MW-25000購(gòu)自美國(guó)Polyscienca公司；Pro 293a-CDM購(gòu)自美國(guó)Lonza公司；HiTrap Protein G HP購(gòu)自GE Health-care；Alexa Fluor594購(gòu)自Jackson Immuno-Research； Human PD-L1購(gòu)自Sino Biological Inc；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自TBD Science；RP1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biosharp；熒光染料Alexa Fluor 594購(gòu)自Jackson公司。

裸鼠，8只，均為雌鼠，體重22 g左右，購(gòu)自蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0004，合格證編號(hào)：No.201709312]。

小動(dòng)物成像儀(德國(guó)Bruker，In-Vivo MS FX PRO)；倒置顯微鏡(日本Olympus，CKX41型)；高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman)；快速液相蛋白分離純化系統(tǒng)(美國(guó)GE，AKTA Explorer 100)。

1.2方法

1.2.1表達(dá)scFv-mFc融合蛋白的真核表達(dá)重組載體構(gòu)建 以識(shí)別人PD-L1蛋白的單鏈抗體的核苷酸序列(由生工公司合成)為模板，PCR擴(kuò)增獲得大量目的基因片段，基因經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切，經(jīng)Assembly Master Mix連接酶連接到同樣被雙酶切的pFuse真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到Trans5a感受態(tài)細(xì)胞，從過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)板上挑取單克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2scFv-mFc融合蛋白的表達(dá)與純化 用大提試劑盒提取重組載體，濃度約1 μg/μl，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(質(zhì)?！肞EI約為2∶3)轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞。收集無(wú)血清培養(yǎng)液中分泌的融合蛋白并使用快速蛋白液相分離純化系統(tǒng)將其進(jìn)行純化。

1.2.3免疫組化 將荷瘤小鼠瘤體剝離，制成石蠟切塊，制片。免疫組化檢測(cè)制備的融合蛋白的活性。適當(dāng)稀釋的融合蛋白(1 μg/μl，稀釋比例1∶200)，用購(gòu)買(mǎi)的兔抗人PD-L1單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照(稀釋1∶200)。

1.2.4scFv-mFc融合蛋白的細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)(流式細(xì)胞術(shù)) 用DMSO將購(gòu)買(mǎi)的Alexa Fluor594溶解為1.5 μg/μl，將A549細(xì)胞用胰酶消化，離心重懸后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)EP管中細(xì)胞數(shù)在1.0×105個(gè)。設(shè)置空白組(不加融合蛋白，只加Alexa Fluor594)，陰性對(duì)照組(加融合蛋白+PD-L1蛋白+Alexa Fluor594)，梯度實(shí)驗(yàn)組(加融合蛋白+Alexa Fluor594，設(shè)置融合蛋白梯度，分別為1 μg、5 μg)。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞結(jié)合的陽(yáng)性率。

1.2.5ADCC實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)靶細(xì)胞A549，用人外周血淋巴細(xì)胞分離液將抽取的外周靜脈血分離，得實(shí)驗(yàn)需要的淋巴細(xì)胞。在試劑盒的96孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白組：靶細(xì)胞+分離的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組：靶細(xì)胞+淋巴細(xì)胞+融合蛋白(觀察與蛋白劑量有無(wú)關(guān)系，設(shè)置加入不同的蛋白量作為對(duì)比，組內(nèi)分別加入蛋白1、3、10 μg)，每組設(shè)置復(fù)孔。放在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)4～6 h，酶標(biāo)儀分別測(cè)每個(gè)孔0.5、1、2、4 h在450 nm處的吸光值，并繪制趨勢(shì)圖。

1.2.6scFv-mFc融合蛋白對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用 在裸鼠后肢處接種A549細(xì)胞，數(shù)量為1.0×106個(gè)。20 d后開(kāi)始記錄裸鼠腫瘤體積(長(zhǎng)徑×短徑2/2)，每2 d測(cè)量1次，記錄8次之后，每只裸鼠腹腔每次注射100 μg的融合蛋白，按上述方法繼續(xù)記錄8次，計(jì)算未注射融合蛋白和注射融合蛋白之后的體積平均增長(zhǎng)率。

1.2.7熒光標(biāo)記融合蛋白注射荷瘤小鼠結(jié)果 荷瘤鼠腹腔注射熒光染料標(biāo)記的融合蛋白，將溶于DMSO的熒光染料加入融合蛋白中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中心小動(dòng)物成像儀和熒光染料的性質(zhì)，選用激發(fā)光波長(zhǎng)720 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)790 nm。通過(guò)腹腔注射，每只荷瘤鼠注射約100 μg熒光標(biāo)記的融合蛋白，觀察不同時(shí)間，融合蛋白在體內(nèi)的分布代謝情況。觀察時(shí)間分別為注射前，注射后30 min，2、4、12、24 h。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩獨(dú)立樣本之間采取t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1表達(dá)scFv-mFc融合蛋白的真核表達(dá)載體構(gòu)建(圖1A)，重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，目標(biāo)scFv-mFc基因片段長(zhǎng)718 bp，與設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因片段相符(圖1B)。

2.2表達(dá)與純化的scFv-mFc融合蛋白(圖2),經(jīng)免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示，融合蛋白與表面高表達(dá)PD-L1蛋白的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的結(jié)合能力(圖3、4)；ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果示融合蛋白在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用(圖5)；荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果示融合蛋白對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到抑制作用，在5 mg/kg的藥物劑量下，荷瘤小鼠瘤體體積平均增長(zhǎng)率從14.90%降低至3.72%，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。通過(guò)熒光標(biāo)記融合蛋白腹腔注射至荷瘤鼠體內(nèi)，小動(dòng)物成像儀觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白在體內(nèi)分布呈一定的趨向性(圖7)。

圖1 表達(dá)scFv-mFc融合蛋白的真核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construct eukaryotic expression recombinant plas-mid which express scFv-mFc fusion proteinNote: A.Construct the eukaryotic expression recombinant plasmid；IL2SP:Signal peptide sequence of human interleukin 2；mFc：Fc segment of mouse IgG2a；B.The result of agarose gel exposure after PCR amplification of scFv gene sequence；C.The recombinant plasmid was digested by restriction endonuclease，and exposured with scFv(1.scFv；2.Recombinant plasmid；M.Marker).

圖2 scFv-mFc融合蛋白的表達(dá)與純化Fig.2 Expression and purification of scFv-mFc fus-ion proteinNote: A.Western blot results of serum-free medium collected after transfection the recombinant plasmid；B.Purify the fusion protein by the rapid liquid protein separation and purification system(AKTA)，and the second peak was collected.

圖4 scFv-mFc融合蛋白流式結(jié)果分析Fig.4 Results of flow analysis of scFv-mFc fusion proteinNote: A.The binding rate of A549 cells in the experimental group was higher than that in the blank group，and the binding rate increased with the increase in the amount of fusion protein(Ab)；B.An experimental group with a certain amount of fusion protein(Ab，5 μg/ml)added，the binding rate of cell A549 was higher than that of the negative control group(added the same amount of fusion protein and a certain amount of PD-L1 protein).The above image shows that the fusion protein scFV-mFc binds specifically to the PD-L1 protein on the surface of A549 cells.

圖5 ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 ADCC resultsNote: Compared with the blank group(with lymphocytes only)，the cell survival rate of the experimental group(plus lymphocytes and fusion protein)was lower.In the experimental group，the cell survival rate was correspondingly decreased with the increase in the amount of fusion protein.

圖6 scFv-mFc融合蛋白對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑瘤率Fig.6 Tumor inhibition rate of fusion protein of scFv-mFc on transplanted tumor of tumor-bearing miceNote: The volume growth rate of each tumor-bearing mice before and after the fusion protein injection was calculated，the results showed that the average tumor volume growth rate of tumor-bearing mice decreased from 14.90% to 3.72% after injecting the fusion protein.The two independent samples was tested byt-test，P<0.05，the difference was statistically significant.This shows that the fusion protein has an inhibitory effect on the tumor in vivo.

圖7 熒光標(biāo)記融合蛋白注射荷瘤鼠結(jié)果Fig.7 Fluorescent-tagged fusion protein injected into tumor bearing miceNote: The fusion protein labeled with red fluorescence was intraperitoneally injected and showed a certain tendency in tumor-bearing mice.As time progressed，it accumulated on the tumor and the tumor turned from the initial low signal to a red high fluorescence signal，demonstrate that the labeled fusion protein can still specifically recognize the PD-L1 protein on the tumor cell surface.

3 討論

癌癥是人類尚未攻克的醫(yī)學(xué)難題，目前常規(guī)的治療手段為手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療等，由于腫瘤本身易擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，這些傳統(tǒng)的治療手段收到的效果都不甚理想。近年來(lái)，使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑來(lái)治療惡性腫瘤的報(bào)道越來(lái)越多，如針對(duì)免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1的單克隆抗體最近應(yīng)用在治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎癌、晚期/難治性非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌[9-12]，有文獻(xiàn)報(bào)道稱PD-L1的單克隆抗體Atezolizumab在晚期非小細(xì)胞肺癌的療效確切、不良反應(yīng)發(fā)生率低[13]。除上述腫瘤外，前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中PD-L1均有較高的表達(dá)[14-16]，這也為免疫治療提供了理論可能。

從腫瘤免疫的提出，到將腫瘤免疫應(yīng)用于臨床治療，經(jīng)歷了近百年的歷史，自從2011年始，多種免疫檢查點(diǎn)阻斷劑和靶向性免疫細(xì)胞藥物在多種惡性腫瘤的臨床治療中取得了較好的效果，極大推動(dòng)了免疫治療從臨床前研究到臨床應(yīng)用的進(jìn)展[17]。2013年，在Science評(píng)選的年度十大科技突破中，腫瘤的免疫治療居首位[18]。

目前研究存在的問(wèn)題是部分患者因個(gè)體差異無(wú)應(yīng)答，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶或免疫應(yīng)答下降，腫瘤復(fù)發(fā)，存在細(xì)胞毒性等。在如何選擇合適生物標(biāo)志物，篩選獲益人群，尋找新靶點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)單一治療藥物及聯(lián)合治療方案的選擇方面仍需不斷深入研究。當(dāng)前關(guān)于腫瘤免疫治療研究的新進(jìn)展也值得我們關(guān)注，比如利用納米載藥系統(tǒng)的生物降解佳、靶向性好、制劑形式多樣化開(kāi)發(fā)的聚合物納米粒、樹(shù)枝狀聚合物等提高腫瘤免疫治療的效率[19]。精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化醫(yī)療的發(fā)展結(jié)合患者情況采用制定最有效治療方案，推動(dòng)腫瘤免疫療法不斷進(jìn)步，提高了該療法的可行性。

隨著研究的不斷進(jìn)展，腫瘤免疫治療必將走向規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。目前腫瘤的免疫治療策略主要集中在阻斷T細(xì)胞的檢查點(diǎn)上，并取得了一定的效果。這些藥物僅對(duì)特定的腫瘤有較好效果，但有明顯的副作用。上文提到的免疫檢查點(diǎn)，PD-1/PD-L1通路，僅是癌癥免疫逃逸的機(jī)制之一。這要求我們更加深入的研究癌癥免疫逃逸的機(jī)制和腫瘤微環(huán)境形成的因素，開(kāi)發(fā)出更加有效的免疫治療藥物。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種途徑逃避或反擊機(jī)體免疫系統(tǒng)，各個(gè)機(jī)制之間相互影響，密切聯(lián)系，現(xiàn)在對(duì)免疫與腫瘤關(guān)系研究不斷深入，但仍未將免疫與腫瘤之間相互攻擊與防御所涉及的細(xì)胞與分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)研究清楚。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z測(cè)融合蛋白的抗腫瘤活性，以期為腫瘤的臨床免疫治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在肺腺癌細(xì)胞A549上有PD-L1蛋白的表達(dá)，融合蛋白能與PD-L1蛋白特異性結(jié)合，并對(duì)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，而裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了融合蛋白的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。以上結(jié)果為PD-L1抗體在肺腺癌臨床免疫治療中提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。