杜仲綠原酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)的調(diào)控作用①

劉 嫻 姜玉珍 田 聘 梁 莉

(南陽醫(yī)專第一附屬醫(yī)院眼科，南陽 473000)

近年來糖尿病的患病率在全球范圍不斷上升，其最常見的并發(fā)癥之一糖尿病性視網(wǎng)膜病變也隨之增加。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是發(fā)達(dá)國家勞動(dòng)力人口視力喪失的主要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變導(dǎo)致的視力障礙對(duì)患者的生活質(zhì)量和他們成功控制疾病的能力產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響[1]。越來越多的研究表明在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中常?？梢詸z測(cè)到一些內(nèi)皮黏附因子的升高，這些因子的升高會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在糖尿病性視網(wǎng)膜病變過程中發(fā)揮著重要作用，因此糖尿病性視網(wǎng)膜病變也被認(rèn)為是一種慢性的輕型炎癥反應(yīng)[2]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，是許多疾病中引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要介子之一，LPS的增加會(huì)導(dǎo)致促炎因子分泌的增強(qiáng)[3]。許多天然產(chǎn)物和植物提取物在抑制炎癥方面發(fā)揮著積極作用[4,5]。杜仲綠原酸(Chlorogenic acid,CA)(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1A)是羥基肉桂酸家族中的一種酚類化合物，這種多酚具有許多促進(jìn)健康的特性，其中大部分都與代謝綜合征的治療相關(guān)，包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗高血壓等活性[6]。本文主要目的是探索CA對(duì)LPS誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(Human retinal endothelial cells,HRECs)凋亡和免疫反應(yīng)的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 CA來源于Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)與規(guī)格： 00500590-10 mg，HPLC≥97%，用DMSO配制成400 μmol/L的母液，使用時(shí)稀釋到所需濃度。LPS來源于Sigma公司,貨號(hào)與規(guī)格： L4516-1 mg，用PBS配制成100 ng/ml的溶液待用。

1.1.2細(xì)胞系及藥物處理 HRECs細(xì)胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。HRECs細(xì)胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時(shí)進(jìn)行傳代。不同濃度(1、2、5、10、20、50、100、200、400 μmol/L)CA處理HRECs后利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10、20、50 μmol/L的CA進(jìn)行處理。HRECs細(xì)胞分為5組：對(duì)照組(HRECs)、模型組(LPS)、CA組(LPS+10、20、50 μmol/L 杜仲綠原酸)。模型組用100 ng/ml的LPS處理。CA組用100 ng/ml的LPS聯(lián)合10、20、50 μmol/L CA進(jìn)行處理。對(duì)照組用DMSO處理。

1.1.3試劑 培養(yǎng)基 DMEM(Thermo Fisher Science,11966-025),胎牛血清(Thermo Fisher Science,10099158)。CCK-8試劑盒(Dojindo Laboratories,CK04)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen,556547)。IL-6的ELISA檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Science,BMS213-2)。TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒(MSK,69-98069)。IL-10的ELISA檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Science,BMS215-2)?？筀i67抗體(Abcam,ab16667)，抗Bcl-2抗體(Abcam,ab32124)，抗Caspase-3抗體(Abcam,ab13585)，抗Bax抗體Abcam,ab32503)，抗NF-κB P65抗體(Abcam,ab16502)?？筆-NF-NF-κB P65抗體(Abcam,ab28856)。

1.1.4儀器 CO2培養(yǎng)箱是賽默飛Thermo 371系列。超凈臺(tái)是賽默飛Heraguard ECO系列。離心機(jī)購自美國貝克曼公司。流式細(xì)胞分析儀來源于BD公司。分光光度計(jì)、光學(xué)顯微鏡，凝膠成像系統(tǒng)及電泳儀由美國伯樂公司提供。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 首先用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測(cè)細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，然后在37℃培養(yǎng)1～4 h，最后在450 nm處檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 收集待測(cè)細(xì)胞后用1×Binding buffer制成1×106個(gè)/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3蛋白印跡 首先將待測(cè)細(xì)胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組待測(cè)細(xì)胞提取物中的炎癥因子水平，首先將樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育45 min，洗滌液洗滌4次后加入生物素標(biāo)記的抗體37℃反應(yīng)30 min。然后加鏈霉親和素-HRP 混勻37℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑，避光顯色15 min后加終止液終止反應(yīng)，450 nm 處檢測(cè)吸光值

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CA對(duì)HRECs細(xì)胞活力的影響 利用CCK-8檢測(cè)CA對(duì)HRECs細(xì)胞活力的影響。由圖1B可知，當(dāng)CA<50 μmol/L時(shí)，HRECs細(xì)胞存活率維持在80%以上，對(duì)HRECs細(xì)胞活力無明顯影響；CA>50 μmol/L 后HRECs細(xì)胞存活率急劇下降，降低到80%以下。上述結(jié)果表明，低濃度(<50 μmol/L)的CA對(duì)HRECs細(xì)胞活力無明顯影響，高濃度(>50 μmol/L)的CA會(huì)減低HRECs細(xì)胞活力。

2.2CA可減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞增殖降低 為分析CA對(duì)LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞增殖的影響，CCK-8檢測(cè)HRECs細(xì)胞增殖倍數(shù)。圖2顯示，LPS組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組細(xì)胞增殖倍數(shù)無明顯變化。20 μmol/L和50 μmol/L的CA組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯高于LPS組(P<0.05)。由此可見，CA具有降低LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞增殖減低的功能。

圖1 CA化學(xué)結(jié)構(gòu)式(A)和CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力(B)Fig.1 Chemical structure of CA(A)and cell viability was detected by CCK-8(B)

2.3CA會(huì)抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡增加 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HRECs細(xì)胞凋亡，分析CA對(duì)LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的影響。如圖3所示，LPS組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。10 μmol/L的CA組與LPS組細(xì)胞凋亡率無明顯差異。與LPS組相比，20和50 μmol/L的CA組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果說明，CA可抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的增加。

2.4CA對(duì)HRECs細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 蛋白印跡檢測(cè)CA對(duì)LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。圖4顯示，LPS組Ki67和Bcl-2表達(dá)明顯低于對(duì)照組，Caspase-3和Bax表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組Bax表達(dá)明顯下降；20 μmol/L和50 μmol/L的CA組Ki67和Bcl-2表達(dá)明顯升高，Caspase-3和Bax表達(dá)明顯降低(P<0.05)。由此可見，CA可減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞Ki67和Bcl-2表達(dá)的減低及Caspase-3和Bax表達(dá)的增強(qiáng)。

2.5CA可抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs的炎癥反應(yīng)增強(qiáng) 利用ELISA檢測(cè)HRECs細(xì)胞炎癥因子水平，分析CA對(duì)LPS誘導(dǎo)的HRECs炎癥反應(yīng)的影響。如圖5所示，LPS處理HRECs細(xì)胞后促炎因子IL-6和TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10水平降低(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組炎癥因子水平無明顯變化；20 μmol/L和50 μmol/L的CA組IL-6和TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。以上結(jié)果說明，CA會(huì)抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。

圖2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖Fig.2 Proliferation was measured by CCK-8Note: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis was tested by flow cytometryNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖4 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of proliferation and apoptosis related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factors were detected by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖6 蛋白印跡檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of NF-κB pathway related protein was detected by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

2.6CA對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為探索CA影響LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測(cè)NF-κB P65和P-NF-κB P65蛋白水平。由圖6可知，LPS組p-P65/P65比值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與LPS組相比，CA(10、20、50 μmol/L)組p-P65/P65比值明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，CA可減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平的升高，抑制NF-κB P65的活化。

3 討論

目前對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療的主要手段是鐳射光凝療法，但經(jīng)過鐳射光凝療法后常會(huì)導(dǎo)致糖尿病性黃斑水腫。近年來也發(fā)現(xiàn)一些糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療方法，如玻璃體切割術(shù)，抗VEFG及非諾貝特等藥物，但許多糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者對(duì)這些療法的反應(yīng)并不理想[7,8]。開發(fā)新的有效的糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療方法迫在眉睫。

越來越多的研究表明多種植物提取物具有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷具有抑制光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞PRE增殖能力降低的功效[10]。Sook Kim等[11]研究表明葛根提取物可減弱丙酮醛誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞PRE的增殖的降低，細(xì)胞凋亡的增加。據(jù)報(bào)道綠原酸可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2表達(dá)的降低和Bax表達(dá)的升高[12]。有研究表明在大鼠髓核細(xì)胞中，綠原酸會(huì)降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)[13]。有數(shù)據(jù)顯示在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞中，綠原酸可抑制乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖降低和細(xì)胞凋亡增加，減弱Bcl-2表達(dá)的降低和Caspase-3表達(dá)的升高[14]。本文結(jié)果顯示，CA可減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞增殖下降和細(xì)胞凋亡增加，抑制Ki67和Bcl-2表達(dá)的減低和Caspase-3和Bax表達(dá)的增強(qiáng)。

炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)是各種疾病的常見特征，大量文獻(xiàn)報(bào)道許多植物提取物具有抗炎的功效。有研究顯示鼓槌石斛提取物可減弱鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞IL-6和TNF-α水平的增加[15]。Tzeng等[16]發(fā)現(xiàn)富含多酚類物質(zhì)的紅球姜提取物可降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放。據(jù)報(bào)道一種黃芪、當(dāng)歸、人參提取物可抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高[17]。有數(shù)據(jù)顯示綠原酸可降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高[18]。有研究表明綠原酸可抑制LPS誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞IL-6水平的升高，減弱炎癥反應(yīng)[19]。據(jù)報(bào)道綠原酸會(huì)降低全氟辛烷磺酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β和IL-6水平的升高[20]。本研究結(jié)果表明，CA可抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞IL-6和TNF-α水平升高和IL-10水平降低。

NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用[21]。有研究發(fā)現(xiàn)印度人參提取物可通過抑制NF-κB通路活化，減弱LPS對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的促炎作用[22]。據(jù)報(bào)道半枝蓮提取物可降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平的升高[23]。有研究表明紅球姜提取物可通過降低NF-κB P65磷酸化水平來減弱鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)[24]。Ye等[25]發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷中綠原酸會(huì)降低P-NF-κB P65蛋白水平的升高[26]。有數(shù)據(jù)顯示綠原酸可通過降低NF-κB P65磷酸化水平抑制LPS誘導(dǎo)的乳腺炎。本文結(jié)果顯示，CA可抑制LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

本研究表明，在LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞中，CA可減弱細(xì)胞增殖的下降和細(xì)胞凋亡的上升，抑制Ki67和Bcl-2表達(dá)的減低和Caspase-3和Bax表達(dá)的增強(qiáng)，減少IL-6和TNF-α水平升高和IL-10水平降低，降低NF-κB P65磷酸化水平的升高。綜上所述，杜仲綠原酸可通過抑制NF-κB P65活化減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。下一步計(jì)劃在動(dòng)物模型中研究CA對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變的調(diào)控作用，為開發(fā)新的糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療方法奠定基礎(chǔ)。