基于肽生物標(biāo)志物技術(shù)鑒別肉品的真實(shí)性研究進(jìn)展

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(1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心,山東聊城 252201;2.東阿阿膠股份有限公司,山東聊城 252201)

肉制品中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白和微量元素,其營養(yǎng)價(jià)值高且口味獨(dú)特,在世界各國的居民食品消費(fèi)中都占有較大的比重[1]。肉類市場需求的增加和不同物種肉的價(jià)格差異,導(dǎo)致了肉品行業(yè)摻假盛行,近期最引人關(guān)注的便是河北省河間市驢肉摻假事件[2]。肉制品摻假不僅侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益,而且嚴(yán)重沖擊了宗教信仰,另外,使用某些患有傳染病的不合格肉冒充新鮮肉,還可能造成疫病傳播和易感人群的過敏等食品安全問題。

目前,以核酸和蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測方法已廣泛應(yīng)用于肉制品的真實(shí)性鑒定?；诤怂岬臋z測方法主要通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)來實(shí)現(xiàn),包括常規(guī)PCR技術(shù)[3-4]、限制性片段長度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)技術(shù)[5-6]、多重PCR技術(shù)[7-8]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[9-10]和微滴數(shù)字PCR技術(shù)[11-12]等;基于蛋白質(zhì)的檢測方法則主要集中于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)[13-14]。此兩類肉品真實(shí)性鑒定方法,特異性強(qiáng)、靈敏度高且定量準(zhǔn)確,但同時(shí)也存在著一些弊端。首先,對(duì)于加工肉制品而言,核酸和蛋白質(zhì)在高溫高壓條件下,易發(fā)生降解[15]和變性,嚴(yán)重影響了定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。其次,對(duì)于復(fù)雜的肉品基質(zhì),PCR反應(yīng)易受基質(zhì)效應(yīng)的干擾[16];而ELISA方法,則無法實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)中多個(gè)物種的同時(shí)檢測。第三,對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種,ELISA方法易發(fā)生物種間的交叉反應(yīng)[17],產(chǎn)生假陽性結(jié)果;而PCR反應(yīng)則需要反復(fù)的引物優(yōu)化,費(fèi)事費(fèi)力。

伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,以肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術(shù)逐漸應(yīng)用于肉制品的真實(shí)性鑒定[18-19]。所謂的肽生物標(biāo)志物是指具有物種相對(duì)特異性的多肽序列,即該多肽序列僅特異性的存在于本物種中,而在研究中的其他物種中不存在。與核酸和蛋白質(zhì)相比較,多肽序列具有更高的穩(wěn)定性,能夠耐受高溫高壓和其他嚴(yán)峻條件的考驗(yàn)[20];同時(shí),作為DNA的表達(dá)產(chǎn)物,多肽具有更高的組織特異性,能很好的區(qū)分開不同物種肉;最后,該方法借助于高靈敏度高掃描速度的LC-MS儀器,可以很容易的實(shí)現(xiàn)多個(gè)物種的同時(shí)檢測,節(jié)約時(shí)間、提高檢測效率。

本文主要從肉中肽生物標(biāo)志物的分離鑒定方法、肽生物標(biāo)志物在鑒定不同肉制品及肉制品中外源蛋白的應(yīng)用三個(gè)方面進(jìn)行論述,并對(duì)肽生物標(biāo)志物在鑒定肉品真實(shí)性應(yīng)用中的發(fā)展方向進(jìn)行展望,以期為食品溯源提供更豐富的技術(shù)手段。

1 肉中肽生物標(biāo)志物的分離鑒定

1.1 肉中蛋白質(zhì)和多肽的分離技術(shù)

肉中蛋白質(zhì)含量豐富且種類多樣,采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)如聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、液相色譜等很難將其分離開來,這就給以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的肉品真實(shí)性鑒定方法帶來了困難和挑戰(zhàn)。伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和分析儀器的不斷升級(jí),高靈敏度、高掃描速度的質(zhì)譜技術(shù)已開始應(yīng)用于肉中蛋白質(zhì)和多肽的分離鑒定,其中應(yīng)用較多的為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)[18,21]、電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-TOF-MS)[22]、三重四級(jí)桿質(zhì)譜[23-24]和液滴萃取表面分析質(zhì)譜(Liquid extraction surface analysis mass spectrometry,LESA-MS)[25-26]。

使用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肉中的蛋白質(zhì)和多肽分離主要集中在以下兩種方法。第一種方法為基于特定蛋白質(zhì)中多肽的分離鑒定,即不同肉制品經(jīng)蛋白質(zhì)提取、SDS-PAGE分離和目標(biāo)蛋白質(zhì)的切膠酶解等前處理過程,最后使用質(zhì)譜儀對(duì)特定蛋白質(zhì)的酶解肽段進(jìn)行分離鑒定,其中應(yīng)用最多的質(zhì)譜儀為MALDI-TOF-MS[18,27]。利用該方法可以很容易的實(shí)現(xiàn)不同物種肉中單一蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析,進(jìn)而找出該蛋白的氨基酸序列在不同物種肉中的差異,利用這些差異性的肽段實(shí)現(xiàn)對(duì)不同物種肉的真實(shí)性鑒定[18]。但該方法也存在著樣品前處理復(fù)雜,費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。第二種方法為基于全蛋白的多肽分離鑒定,即不同肉制品經(jīng)蛋白質(zhì)提取和胰蛋白酶消化兩步處理后,直接進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽的分離鑒定[22,28]。該方法無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)凝膠分離過程,節(jié)省時(shí)間和人力[22-24,28];消化后的多肽樣品經(jīng)一次分離鑒定,就可獲得該物種的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和多肽,與特定蛋白質(zhì)中的多肽分析相比較,此方法得到的肽生物標(biāo)志物信息更加豐富可靠。但同時(shí)該方法也存在著數(shù)據(jù)處理繁瑣的缺點(diǎn)。

1.2 肉中蛋白質(zhì)和多肽的鑒定方法

蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物經(jīng)LC-MS電離分析后,將提取到每個(gè)肽段的質(zhì)譜圖,而得知每個(gè)肽段的蛋白質(zhì)種屬來源和氨基酸組成,則需進(jìn)一步借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比分析。目前,基于數(shù)據(jù)庫檢索的方式鑒定蛋白質(zhì)和多肽序列的方法主要有兩種,一是肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint,PMF)技術(shù)[19,29],即蛋白質(zhì)經(jīng)特異性的酶(通常為胰蛋白酶)酶解后,采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)酶解后的多肽混合物進(jìn)行質(zhì)量分析,這些特征性多肽的質(zhì)量就構(gòu)成了該消化蛋白的肽指紋圖譜。蛋白分析時(shí),將這些肽段的質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中所有蛋白質(zhì)的理論酶切結(jié)果相比較,根據(jù)得分的高低來實(shí)現(xiàn)對(duì)未知蛋白的鑒定。PMF的關(guān)鍵是準(zhǔn)確測量不同肽段的分子質(zhì)量,但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)出現(xiàn)翻譯后修飾的現(xiàn)象,會(huì)引起肽分子質(zhì)量的遷移,使PMF的質(zhì)量數(shù)與理論值不相符合,給蛋白質(zhì)的鑒定帶來困難,這一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。第二種方法為肽碎片離子鑒定法。在串聯(lián)質(zhì)譜的低能量碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-induced dissociation,CID)模式下,將待測肽段的峰打碎,通過計(jì)算相鄰?fù)愋头宓馁|(zhì)量差,同時(shí)結(jié)合肽段母離子的質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)對(duì)未知肽段的氨基酸組成分析[30]。但在實(shí)際的氨基酸序列解析中,由于不同的碎片可能帶有不同的電荷、肽段的類型不單一或有雜質(zhì)分子的干擾,都會(huì)給氨基酸序列的解析帶來影響。

1.3 肉中肽生物標(biāo)志物的找尋及確認(rèn)

LC-MS法鑒別不同肉制品最為關(guān)鍵的是:找尋到不同物種肉的特異性肽生物標(biāo)志物。在肉類摻假鑒定中,所謂的特異性肽生物標(biāo)志物是指:該多肽序列僅特異性的存在于本物種中,而在研究中的其他物種中不存在,且該肽段所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為高豐度蛋白[22,31]。目前,主要通過數(shù)據(jù)庫檢索的方式,實(shí)現(xiàn)潛在肽生物標(biāo)志物的找尋。在利用數(shù)據(jù)庫找尋目標(biāo)物種的潛在肽生物標(biāo)志物時(shí),首先應(yīng)找出在所有研究物種中同時(shí)存在的蛋白質(zhì),之后比較該蛋白在不同物種中的氨基酸組成,最后找出僅在目標(biāo)物種中存在的特異性肽段,這些特異性肽段就為目標(biāo)物種的潛在肽生物標(biāo)志物。通過數(shù)據(jù)庫檢索到的潛在肽生物標(biāo)志物,可能會(huì)由于數(shù)據(jù)庫的缺失或物種親緣關(guān)系較近,而產(chǎn)生假陽性的結(jié)果,因此有必要對(duì)潛在肽生物標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)際物種測試,以進(jìn)一步確認(rèn)其特異性。

伴隨著質(zhì)譜儀器的發(fā)展,四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)控(Multiple-reaction monitoring,MRM)掃描模式已成功運(yùn)用于肽生物標(biāo)志物的特異性分析。MRM是基于肽的已知或者假定信息,有針對(duì)性的獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)的一種技術(shù)。具體地,MRM是根據(jù)多肽的母離子和子離子的質(zhì)量數(shù)信息,構(gòu)建出該肽的母離子/子離子對(duì),符合要求的母離子進(jìn)入碰撞室,碰撞打碎后,在二級(jí)掃描中記錄子離子信號(hào),通過母離子和子離子的前后兩次選擇,可以有效的排除干擾,提高方法的特異性和靈敏度[32]。

MRM確認(rèn)肽生物標(biāo)志物的特異性具有很多優(yōu)勢。首先,準(zhǔn)確度高;MRM實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定肽段的多個(gè)母離子/子離子對(duì)的雙重選擇鑒定,特異性強(qiáng),準(zhǔn)確度高。其次,結(jié)果容易觀察;判斷肽生物標(biāo)志物的特異性,只需觀察該肽在不同物種中的MRM峰保留時(shí)間,無需其它繁雜的數(shù)據(jù)處理。第三,快速高效;根據(jù)不同肽段的出峰時(shí)間,可以實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣數(shù)百個(gè)肽段的同時(shí)分析鑒定。此外,MRM方法除了可以確認(rèn)肽生物標(biāo)志物的特異性外,還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)中的定量分析[33]。

2 肽生物標(biāo)志物在鑒定不同肉制品中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)作為DNA的表達(dá)產(chǎn)物,與DNA相比較,蛋白質(zhì)具有更高的組織特異性,而DNA 在同一個(gè)體不同組織之間沒有差異[34],同時(shí),多肽鏈的氨基酸組成作為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu),具有很高的特異性和穩(wěn)定性,能很好的耐受外界環(huán)境(高溫、高壓和酸堿度)的干擾。伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的興起,以特異性肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的LC-MS方法逐漸用于肉制品的真實(shí)性鑒定[35]。

Taylor等[36]首次采用質(zhì)譜技術(shù),對(duì)來自不同物種中的血紅蛋白和肌紅蛋白進(jìn)行了分析比較,并提出了該技術(shù)可以潛在的應(yīng)用于不同物種肉的鑒定。2010年,Sentandreu等[18]提出了一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,檢測混合肉中的雞肉成分;首先使用LC-MS技術(shù)對(duì)雞肉中的肌球蛋白輕鏈3酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定,之后分別繪制不同比例雞肉含量的混合肉與雞的肽生物標(biāo)志物豐度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以此來進(jìn)行混合肉的定量分析,結(jié)果顯示該方法可以檢測出豬肉中0.5%的雞肉含量。伴隨著2013年歐洲“馬肉丑聞”的曝光以及PCR技術(shù)在檢測加工肉制品中的缺陷,越來越多的研究集中于利用肽生物標(biāo)志物技術(shù)檢測肉制品中的馬肉[22,27]和清真肉[28,37]成分。液滴萃取表面分析質(zhì)譜(LESA-MS)作為一種新的分析技術(shù),也已開始應(yīng)用于肉制品的真實(shí)性鑒定中[25-26,38],且有報(bào)道該方法比傳統(tǒng)的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)有更高的靈敏度和穩(wěn)定性[25]。國內(nèi),以肽生物標(biāo)志物技術(shù)檢測肉制品的真實(shí)性研究起步較晚,李瑩瑩等[39]利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法找尋出羊肉和鴨肉的特異性多肽,并分別選擇兩種肉響應(yīng)較好的5條特異性多肽進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明,該方法可以檢測出羊肉中0.5%的鴨肉含量。張穎穎等[40]建立了一種定量牛肉中豬肉和雞肉成分的LC-MS方法,首先采用高分辨率質(zhì)譜分別找出牛肉、豬肉和雞肉的潛在肽生物標(biāo)志物,之后采用質(zhì)譜MRM模式,對(duì)潛在肽生物標(biāo)志物進(jìn)行特異性確認(rèn),最后分別選擇3種肉的3組特異性肽進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,該方法與較常用的PCR方法檢測結(jié)果相一致,定量限達(dá)到0.5%,特異性強(qiáng)準(zhǔn)確度高。除用廉價(jià)的肉代替高昂的肉制品摻假外,在肉中添加其他外源性蛋白也是肉制品摻假的一種常見方式,接下來對(duì)以肽生物標(biāo)志物技術(shù)檢測肉制品中的外源性蛋白成分進(jìn)行綜述。

3 肽生物標(biāo)志物在鑒定肉制品中外源蛋白的應(yīng)用

外源蛋白質(zhì)的添加可以明顯改善肉制品的功能性質(zhì),例如增加肉的持水性和改進(jìn)肉的組織結(jié)構(gòu)等[41],同時(shí),外源蛋白質(zhì)的添加也降低了肉制品的加工成本,給一些不法分子帶來可乘之機(jī)?，F(xiàn)在,一些國家的法律法規(guī)已明確禁止或限制在肉類加工過程中蛋白質(zhì)的添加量,因此,有必要開發(fā)一種強(qiáng)有力的分析技術(shù)來控制這種欺詐行為。肽生物標(biāo)志物技術(shù)作為一種有效的分析方法,已開始應(yīng)用于肉制品中外源蛋白的分析檢測。

Leitner等[42]開發(fā)了一種以蛋白質(zhì)和多肽為標(biāo)志物的方法,鑒定加工肉制品中的大豆蛋白成分,包括大豆分離蛋白的提取和預(yù)分離、胰蛋白酶的消化以及LC-MS的分離鑒定,結(jié)果表明,該方法能很好地區(qū)分肉制品中的大豆蛋白成分,且可以用于定量分析。Hoffmann等[43]建立了一種同時(shí)檢測肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆成分的LC-MS方法,樣品經(jīng)蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化和LC-MS分析鑒定后,每種豆類分別選取3～4個(gè)肽生物標(biāo)志物進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明,該方法可以最低檢測到肉制品中2、5和4 mg/kg的羽扇豆、豌豆和大豆成分,方法特異性高,無交叉污染。

外源蛋白的添加除降低加工成本外,還可能會(huì)引起易感人群的過敏癥狀[44],利用肽生物標(biāo)志物技術(shù)找尋不同食品中的過敏原也是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)研究方向。Heick等[45]開發(fā)了一種同時(shí)檢測不同食物中七種過敏原的LC-MS方法,檢測結(jié)果與市售ELISA試劑盒分析結(jié)果相比較,兩者無顯著性差異。Montowska等[46]利用LC-QTOF-MS技術(shù)開發(fā)了一種檢測禽肉制品中非肉類蛋白成分的方法,利用該方法可以檢測到加工禽肉制品中關(guān)于大豆、牛奶和蛋清蛋白中的43個(gè)、9個(gè)和12個(gè)熱穩(wěn)定性肽生物標(biāo)志物,且這些多肽所對(duì)應(yīng)的蛋白多為致敏性蛋白。

4 肽生物標(biāo)志物在鑒定肉品真實(shí)性應(yīng)用中的發(fā)展方向

檢測速度是評(píng)價(jià)檢測方法優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo),以肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的肉品真實(shí)性鑒定方法的檢測速度,很大程度上依賴于蛋白質(zhì)的消化速率。在目前的相關(guān)研究中,為了獲得最大的蛋白質(zhì)覆蓋率,提取到的肉類蛋白質(zhì)通常在胰蛋白酶消化液中,37 ℃條件下反應(yīng)12 h,此過程是耗時(shí)的,很難適應(yīng)肉制品的快速定性和定量分析。此前已有報(bào)道,通過微波[47]、高壓[48]和超聲[49]的方式可加速胰蛋白酶的消化過程,Carrera等[50]利用高強(qiáng)度聚焦超聲的方式輔助胰蛋白酶的消化,成功用于不同魚類物種的分析鑒定,且整個(gè)消化過程只有2 min。消化時(shí)間的縮短可最大限度的減少樣品前處理時(shí)間,后續(xù)僅需約20 min的LC-MS采集時(shí)間即可完成對(duì)肉品真實(shí)性的認(rèn)證,檢測時(shí)間遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法。

肽生物標(biāo)志物的特異性關(guān)系到整個(gè)LC-MS方法的準(zhǔn)確度。伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和質(zhì)譜儀器的更新?lián)Q代,新一代的MRM3掃描在定量分析中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢,該技術(shù)能很好的降低背景噪音,消除非目標(biāo)峰的干擾,提高定量結(jié)果的靈敏度,目前,該技術(shù)已在von Bargen[22-23]的研究中得到嘗試。此外,平行反應(yīng)監(jiān)測(Parallel reaction monitoring,PRM)作為MRM的升級(jí)技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)和肽段的選擇性檢測,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽段的絕對(duì)定量分析。

5 結(jié)語

肽生物標(biāo)志物技術(shù)作為一種新興的肉品真實(shí)性鑒定手段,其特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性都能與傳統(tǒng)的PCR方法相媲美。除此之外,該技術(shù)還存在著穩(wěn)定性強(qiáng)和快速高效的特點(diǎn),這就使得該方法對(duì)大量的、復(fù)雜的和不同加工程度的肉制品分析更有優(yōu)勢。該方法的提出,不僅豐富了肉品真實(shí)性鑒定手段,打擊了不法犯罪,而且對(duì)整個(gè)食品行業(yè)的溯源工程也起到了積極的推動(dòng)作用。

同時(shí),作為一種行之有效且非常有前途的分析方法,肽生物標(biāo)志物技術(shù)在今后的肉制品真實(shí)性鑒定方面具有以下發(fā)展趨勢:不斷優(yōu)化樣品前處理過程,提高檢測方法的重復(fù)性;縮短全過程檢測時(shí)間,提高檢測速率;伴隨分析儀器的更新?lián)Q代,提高檢測方法的特異性和靈敏度。

總之,伴隨著樣品前處理方法的改進(jìn)和蛋白質(zhì)組學(xué)的日漸成熟,以肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的LC-MS技術(shù)在物種的認(rèn)證和檢測肉制品的真實(shí)性方面有著廣闊的發(fā)展空間。