發(fā)酵條件對膠原蛋白肽酸奶質(zhì)構特性的影響

董世榮，李欣，張晨，夏水英，王思雨

（哈爾濱學院食品工程學院，哈爾濱150086）

0 引 言

膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白[1-4]，屬于模塊化蛋白質(zhì)家族的典型代表[5]。膠原蛋白因良好的生物可降解性及生物活性被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域[6]，在降血壓、抗氧化等方面有良好的功效[7-8]。但具有獨特三股螺旋結構[9]的膠原蛋白結構較穩(wěn)定，消化吸收困難。但膠原蛋白肽可被有效吸收利用，羥脯氨酸、脯氨酸等含量較高，而色氨酸、酪氨酸等含量較低[10-12]。膠原蛋白肽在酸性條件下具有很好的分散性和乳化穩(wěn)定性[13]，添加至酸奶中可豐富其營養(yǎng)價值，改善其功能特性。本研究通過測定添加不同量膠原蛋白肽、蔗糖、發(fā)酵菌種酸奶的質(zhì)構特性，綜合評價發(fā)酵條件對膠原蛋白肽酸奶質(zhì)構特性影響規(guī)律，為實際生產(chǎn)膠原蛋白肽酸奶奠定理論基礎。

1 實 驗

1.1 材料

膠原蛋白肽：深海鱈魚膠原蛋白肽，主要為Ⅰ型膠原蛋白肽，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)≥99%，分子肽量1000～3000 u；鮮牛奶（符合GB19301-2010規(guī)定[14])；脫脂奶粉（符合GB19644-2010規(guī)定[15]）；混合乳酸菌種為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。

1.2 儀器與設備

LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海-恒科技有限公司；BCD-458WDV型冰箱，海爾；CT 3型食品物性測定儀，美國Brookfield；TD5A-WS型臺式低速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；FE28型臺式酸度計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；BZD 95自動封口機，溫州盛典包裝機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白肽酸奶制備的工藝流程

鮮牛奶溶解脫脂奶粉(蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)3.0%)→添加膠原蛋白肽→均質(zhì)→預熱(60℃)→蔗糖調(diào)配→殺菌(90℃，10 min)→冷卻(42℃)→接種發(fā)酵劑→裝瓶→發(fā)酵(42℃)→冷卻→后熟(4℃)→成品[16]

1.3.2 不同添加量膠原蛋白肽酸奶的制備

按白砂糖添加量6%，發(fā)酵劑接種量為0.1%，膠原蛋白肽添加量分別為0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%；在42℃的恒溫箱中發(fā)酵至凝乳，4℃后熟18 h，測定酸奶的質(zhì)構特性[17]。

1.3.3 不同添加量蔗糖膠原蛋白肽酸奶的制備

按膠原蛋白肽添加量0.6%，發(fā)酵劑接種量為0.1%，蔗糖添加量分別為4%，5%，6%，7%，8%；在42℃的恒溫箱中發(fā)酵至凝乳，4℃后熟18 h，測定酸奶的質(zhì)構特性。

1.3.4 不同添加量菌種發(fā)酵劑膠原蛋白肽酸奶的制備

按膠原蛋白肽添加量0.6%，蔗糖添加量為6%，菌種發(fā)酵劑添加量分別為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%（均為質(zhì)量分數(shù)，下同）；在42℃的恒溫箱中發(fā)酵至凝乳，4℃后熟18 h，測定酸奶的質(zhì)構特性。

1.3.5 酸奶質(zhì)構特性的測定

利用美國Brookfield公司生產(chǎn)的CT 3型質(zhì)構儀測定酸奶凝膠的質(zhì)構特性。在室溫下采用TPA模式[18]測定酸奶凝膠的硬度、黏性、彈性、膠著性、咀嚼性和內(nèi)聚性。具體參數(shù)設置如下：探頭為TA4/1000探頭，測試前速度為2.0 mm/s，測試后速度為2.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，穿透測試深度為30.0 mm/s，感應力為10.0 g。

1.3.6 微觀結構的測定

利用掃描電鏡分別觀察添加0.0%和0.6%膠原蛋白肽的酸奶樣品的微觀結構[19]，具體步驟如下：（1）從表面＞10 mm處取4 mm×4 mm×3 mm（長×寬×高）酸奶樣品；（2）將其固定在質(zhì)量分數(shù)為25 g/kg戊二醛濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液（p H＝6.8）中24 h（環(huán)境溫度4℃）；（3）利用濃度為0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（p H＝6.8）沖洗3次，每次10 min；（4）先后利用體積分數(shù)為50%，70%，90%的乙醇各脫水1次，每次15 min；（5）利用體積分數(shù)100%的乙醇脫水3次，脫水10 min；（6）等體積的100%乙醇和叔丁醇混合溶液脫水1次，脫水10 min，純叔丁醇脫水1次，脫水10 min；（7）冷凍干燥；（8）固定、鍍金；（9）上鏡觀察微觀結構（25 k V）。

2 結果與分析

2.1 酸奶微觀結構的分析

在牛奶中添加0和0.6%兩個質(zhì)量分數(shù)的膠原蛋白肽，再分別添加質(zhì)量分數(shù)為6%的蔗糖、0.1%菌種接種量，在42℃發(fā)酵6 h，觀察兩者的微觀形態(tài)存在較大的差異，結果圖1所示。

由圖1可以看出，膠原蛋白肽的添加改變了酸奶的微觀形態(tài)，未添加膠原蛋白肽的酸奶樣品的凝膠網(wǎng)絡結構有規(guī)則、蛋白質(zhì)分布更平滑和具有系統(tǒng)性，但是孔隙度較大，并且表面存在不均勻的狀況。與未添加膠原蛋白肽的酸奶的微觀結構相比較，添加膠原蛋白肽酸奶其微觀結構較均勻、細膩，結構緊致，而且孔隙度較為均勻。酸奶的微觀結構與質(zhì)構特性密切相關[20]，膠原蛋白肽的加入破壞了酸奶蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，而蛋白質(zhì)交聯(lián)程度與酸奶凝膠質(zhì)構特性中的硬度呈正相關[21]。因此測定了酸奶的質(zhì)構特性。

圖1未添加和添加膠原蛋白肽酸奶樣品的微觀結構

2.2 膠原蛋白肽添加量對酸奶質(zhì)構特性的影響

在牛奶中添加0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%五個質(zhì)量分數(shù)梯度的膠原蛋白肽，再分別添加質(zhì)量分數(shù)6%的蔗糖、0.1%菌種接種量，在42℃發(fā)酵發(fā)酵6 h，觀察酸奶樣品的硬度(Ha)、黏性(Ad)、彈性(Sp)、膠著性（Gu）、咀嚼性（Ch）和內(nèi)聚性（Co）的變化如圖2所示。

圖2中，原蛋白肽的酸奶樣品的質(zhì)構特性：硬度為Ha，、黏性為Ad，、彈性為Sp，、膠著性為Gu，、咀嚼性為Ch，、內(nèi)聚性為Co）。下同。隨Cpa的變化膠原蛋白肽的添加顯著改變了酸奶的硬度、黏性、膠著性和咀嚼性，隨著Cpa增加這4個指標整體均呈現(xiàn)衰減趨勢，但膠原蛋白肽的添加對酸奶的彈性幾乎無影響，膠原蛋白肽的添加對內(nèi)聚性的影響較小。當Cpa添加至0.8%時，硬度、黏性、膠著性、咀嚼性衰減十分迅速，分別由未添加時的236 g，5.27 m J，105 g和8.30 mJ快速下降至0.8%添加量時的183.5 g，4 m J，69 g和5.95 mJ，分別降低了22.2%，24.1%，34.3%和28.3%，4個指標的衰減速度較為一致。內(nèi)聚性由未添加時的0.40降低至0.37，降低的幅度為7.5%。酸奶黏性與乳中酪蛋白尺寸密切相關，尺寸越小黏性越低[20]，膠原蛋白肽可能影響酸奶中酪蛋白膠束的形成，進而降低了酸奶的黏性。

圖3中，歸一化后的膠原蛋白肽酸奶：硬度為(Hag)，黏性為(Ad g)，彈性為（Sp g），膠著性為（Gug），咀嚼性為（Chg）和內(nèi)聚性為（Cog），下同。

為定量表示添加量Cpa對酸奶硬度、黏性、彈性、膠著性、咀嚼性和內(nèi)聚性的影響規(guī)律，本研究采用Logistic模型擬合歸一化的硬度（Hag）、黏性（Ad g）和膠著性（Gug），采用Holiday模型擬合歸一化的彈性(Spg)，采用Exp3P2模型擬合歸一化的咀嚼性（Chg）和內(nèi)聚性(Cog)（圖3），指標歸一化值表示添加不同量膠原蛋白肽酸奶樣品的指標測量值與未添加膠原蛋白肽酸奶樣品指標測量均值的比值，利用最小二乘法回歸分析得到的Hag，Ad g，Spg，Gug，Chg和Cog經(jīng)驗模型分別表示為

圖2不同添加量膠原蛋白肽的酸奶樣品的質(zhì)構特性隨添加量Cpa的變化

2.3 蔗糖的添加量對酸奶質(zhì)構特性的的影響

在牛奶中添加質(zhì)量分數(shù)為4%，5%，6%，7%，8%五個梯度的蔗糖，再分別添加0.6%的膠原蛋白肽、0.1%菌種接種量，在42℃發(fā)酵發(fā)酵不同時間6h，觀察酸奶樣品的硬度(Ha)、黏性(Ad)、彈性(Sp)、膠著性（Gu）、咀嚼性（Ch）和內(nèi)聚性（Co）的變化如圖4所示。

圖3膠原蛋白肽添加量變化歸一化膠原蛋白肽酸奶的回歸分析結果

蔗糖的添加顯著改變了酸奶的硬度、黏性、膠著性和咀嚼性，隨著蔗糖添加量（Sua）增加這4個指標整體均呈現(xiàn)衰減趨勢，但蔗糖的添加對酸奶的彈性和內(nèi)聚性的影響較小。由圖4可以看出，當Sua添加從4%增加至0.8%時，硬度、黏性、膠著性、咀嚼呈現(xiàn)快速降低的趨勢，分別由蔗糖添加量為4%時的267.67 g，7.50 mJ，105.67 g和9.53 mJ快速下降至0.8%添加量時的232 g，6.20 mJ，90.67 g和8.10 mJ，分別 降 低了13.3%，17.33%，14.2%和15.0%，4個指標的衰減速度較為一致。內(nèi)聚性由未添加時的0.40降低至0.39，降低的幅度為2.5%，變化幅度很小。

為定量表示Sua對酸奶硬度、黏性、彈性、膠著性、咀嚼性和內(nèi)聚性的影響規(guī)律，本研究采用Logistic模型擬合歸一化的硬度（Hag），Logistic1模型擬合歸一化的黏性（Ad g），Parabola模型擬合歸一化彈性（Sp g），Ex-p Dec3模型擬合歸一化的膠著性（Gug），采用Holiday模型擬合歸一化的彈性(Sp g)，采用采用Exp3P2模型擬合歸一化的咀嚼性（Chg）和內(nèi)聚性(Cog)如圖5，利用最小二乘法回歸分析得到的Hag，Ad g，Sp g，Gug，Chg和Cog經(jīng)驗模型分別表示為

2.4 菌種的添加量對酸奶質(zhì)構特性的影響

在牛奶中添加質(zhì)量分數(shù)為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%五個梯度的菌種，再分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.6%的膠原蛋白肽、0.1%菌種接種量，在42℃發(fā)酵發(fā)酵6 h，觀察膠原蛋白肽酸奶樣品的發(fā)酵狀態(tài)，結果如圖6所示。

圖6菌種添加量的變化酸奶樣品質(zhì)構特性隨添加量Sta的變化

改變菌種的添加量（Sta）改變了酸奶的硬度、黏性、彈性、膠著性、咀嚼性和內(nèi)聚性，但是隨著Sta增加這6個指標整體變化趨勢和幅度存在差異。當Sta添加量從0.05%增加至0.4%時，硬度呈現(xiàn)上升的趨勢，從231.67 g增加至250 g，上升的幅度為7.9%，粘性和彈性呈現(xiàn)先變化平穩(wěn)后迅速下降的趨勢，分別從0.05%菌種添加量時的5.55 mJ和9.13 mm下降至0.4%菌種添加量時的4.47 mJ和8.89 mm，分別下降了19.5%和2.6%；膠著性和內(nèi)聚性呈現(xiàn)先略微下降后上升的變化趨勢，2者分別從0.05%菌種添加量時的87.67 g和0.38升高至0.4%菌種添加量時的92.33 g和0.37，分別下降了5.3%和2.6%；但是菌種添加量對酸奶樣品的咀嚼性影響較小。

圖7菌種添加量的變化歸一化的膠原蛋白肽酸奶的回歸分析結果

為定量表示Sta對酸奶硬度、黏性、膠著性、咀嚼性的影響規(guī)律，本研究采用不同類型數(shù)學模型擬合質(zhì)構特性的變化規(guī)律，如圖7所示。分別采用Logistic模型擬合歸一化的硬度（Hag）和黏性（Ad g），采用Exp3P2模型擬合歸一化的彈性（Sp g）、膠著性（Gug）、咀嚼性（Chg）和內(nèi)聚性(Cog)，利用最小二乘法回歸分析得到的Hag，Adg，Sp g、，Gug，Chg，Cog經(jīng)驗模型分別表示為

3 結 論

膠原蛋白肽的添加改善了酸奶的微觀結構，降低了酸

奶的硬度、黏性、膠著性和咀嚼性，但是對彈性和內(nèi)聚性的影響較小。蔗糖添加量和菌種添加量的顯著改變了膠原蛋白肽酸奶的包括硬度、黏性、膠著性和咀嚼性等質(zhì)構特性，但是對彈性和內(nèi)聚性的改變程度較小。提出了定量評估膠發(fā)酵條件對各類指標歸一化結果影響程度的經(jīng)驗模型。