外周血循環(huán)腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制調(diào)控的EP方案治療小細胞肺癌的研究?

聶啟鴻，劉華峰，盧燕軍

(江西省贛州市人民醫(yī)院腫瘤科 341000)

肺癌是世界范圍內(nèi)病死率較高的惡性腫瘤之一，而小細胞肺癌占肺癌發(fā)病率的20%～25%[1]，其為臨床上常見的未分化惡性腫瘤，細胞倍增時間短、進展速度快[2]。小細胞肺癌患者早期表現(xiàn)為血行轉(zhuǎn)移，對化療較為敏感[3]。外周血循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是惡性腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的關鍵因素，與患者的預后密切相關[4]。分析CTCs水平對評估惡性腫瘤的復發(fā)和藥物療效及指導臨床合理用藥具有重要的價值。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南推薦的小細胞肺癌一線治療方案為依托泊苷聯(lián)合順鉑(EP)方案和伊立替康聯(lián)合順鉑(IP)方案[5]。本研究分析外周血CTCs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制調(diào)控的EP方案治療小細胞肺癌的效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年5月至2017年5月EP方案治療的100例小細胞肺癌患者(觀察組)，其中男64例，女36例，年齡43～67歲，平均(55.1±9.8)歲。以本院同期IP方案治療的100例小細胞肺癌患者為對照組，其中男63例，女37例，年齡42～68歲，平均(55.9±10.2)歲。納入標準：(1)符合原衛(wèi)生部《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》(2011年版)中非小細胞肺癌的診斷標準；(2)均經(jīng)過病理學確診為小細胞肺癌；(3)臨床資料完整并同意本研究。排除標準：(1)并發(fā)其他惡性腫瘤；(2)臨床資料不完整；(3)有嚴重的認知功能障礙；(4)有嚴重的心腎功能異常。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均知情同意。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方法 對照組患者行IP方案：第1、8天靜脈滴注伊立替康165 mg/m2和順鉑30 mg/m2。觀察組患者行EP方案：第1～3天靜脈滴注依托泊苷100～125 mg/m2和順鉑25 mg/m2。兩組治療21 d為1個周期，共治療4個周期，治療結束后評價療效。

1.2.2外周血CTCs分離計數(shù) 采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，常溫保存并富集腫瘤細胞。3 000 r/min離心15 min后棄去上清液，加入紅細胞裂解液，溫孵震蕩后離心去除上層紅細胞。再次離心去除上清液后將所得細胞液與Miltenyi免疫磁珠混合、孵育，并經(jīng)過強磁場作用去除白細胞，富集上皮來源的稀有細胞，用免疫熒光染色技術鑒定CTCs并進行計數(shù)。

1.2.3療效評價 本研究按照實體瘤療效標準對兩組研究對象的治療效果進行評價，完全緩解(CR)：目標病灶消失，至少維持4周；部分緩解(PR)：基線病灶最大徑之和降低30%，至少維持4周；穩(wěn)定(SD)：基線病灶最大徑之和減少但達不到30%；進展(PD)?？陀^緩解(CR+PR)認為有治療效果。

1.2.4熒光定量PCR法 熒光定量PCR采用羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR儀進行。擴增體系：2×qPCR Mix 5 μL，上下游引物各10 pmol，cDNA模板2 μL，超純水1 μL，反應體系共10 μL。擴增反應條件：95 ℃，10 s；60 ℃，40 s，共30個循環(huán)?！鰿t=待檢基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附測定法 鈣離子依賴的細胞黏附素家族(E-cadherin)檢測試劑盒購自R&D公司，β-catenin 檢測試劑盒購自Abcam公司，細胞角蛋白-19(CK-19)檢測試劑盒購自ABclonal公司，波形蛋白(Vimentin)檢測試劑盒購自Omega公司，所有檢測過程均按照試劑盒說明書要求進行。

2 結 果

2.1兩組治療小細胞肺癌臨床效果分析 觀察組CR+PR比例為60.0%，明顯高于對照組的46.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.546，P=0.007)，見表1。

表1 兩方案治療小細胞肺癌臨床效果分析[n(%)]

2.2兩組治療后CTCs數(shù)目及表型變化分析 兩組治療后CTCs陽性表達例數(shù)及計數(shù)均明顯降低，且對照組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表2。

表2 兩組治療后CTCs數(shù)目及表型變化分析

2.3兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA變化分析 兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA水平明顯降低，且觀察組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA變化分析

表4 兩組治療前后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表達變化分析

2.4兩組治療后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表達變化分析 兩組治療后E-cadherin、β-catenin、Vimentin蛋白水平明顯降低而CK-19蛋白水平明顯升高，且觀察組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表4。

3 討 論

肺癌是威脅人類健康和生存的自常見的惡性腫瘤，且隨著環(huán)境條件的惡化，其發(fā)病率和病死率有逐年升高的趨勢[6]。小細胞肺癌分化程度低、生長快，早期易于轉(zhuǎn)移和侵犯血管，但對放療和化療較為敏感[7]。EP方案和IP方案是臨床治療小細胞肺癌的推薦方案，且已經(jīng)證實其對小細胞肺癌的療效。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是具有極性的上皮細胞在特定的病理或生理條件下轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞的過程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是惡性腫瘤遷移能力和侵襲能力的重要機制，參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生與一系列蛋白的表達有關，如E-cadherin和Vimentin等。已有的證據(jù)顯示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化涉及的信號通路或細胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子、雄激素受體及CTCs等。在分析上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控蛋白在前列腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及其臨床預后診斷價值的研究中發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移有關，E-cadherin有可能作為患者臨床預后的診斷指標之一[8]。E-cadherin、Vimentin在不同病理分期宮頸癌中的表達存在差異性，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到關鍵的作用[9]。Vimentin在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)組織中表達增強，而E-cadherin則表達降低，提示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程在OSCC發(fā)生及進展過程中發(fā)揮重要作用[10]，同時鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail可能通過參與調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程從而在乳腺癌的發(fā)生和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，并推動乳腺癌的遠處淋巴結轉(zhuǎn)移[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)EP方案和IP方案治療后E-cadherin、Vimentin蛋白水平明顯降低，且EP方案患者的上述指標降低更顯著。β-catenin也是與腫瘤病理學過程密切相關的生物大分子，且與腫瘤的增殖及細胞凋亡過程密切相關[12-13]。在分析β-catenin和E-cadherin在食管鱗癌腫瘤芽殖中的表達時也證實食管鱗癌腫瘤芽殖中的β-catenin高表達和E-cadherin低表達與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移關系密切[14]。以往的研究也證實β-catenin在胃腫瘤組織中表達水平顯著升高，增殖細胞核抗原(PCNA)診斷胃腫瘤的價值高于β-catenin,但PCNA、β-catenin均可以作為胃腫瘤預后評估指標[15]。本研究也證實EP方案和IP方案治療后CTCs陽性表達例數(shù)及計數(shù)均明顯降低，β-catenin蛋白水平明顯降低，且EP方案患者的上述指標降低更顯著，表明EP治療方案對小細胞肺癌有較好的效果，可能與其抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子β-catenin有關。

綜上所述，EP治療方案對小細胞肺癌有較好的效果，可能與其抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關。