CYP116B家族單加氧酶的發(fā)現(xiàn)、表征及分子改造研究進(jìn)展

李仁結(jié)，張 龑，許建和，郁惠蕾

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

單加氧酶利用一些有機(jī)輔因子將電子傳遞給O2分子實(shí)現(xiàn)O2分子的激活，從而在底物中引入單個氧原子。單加氧酶需要的主要輔因子包括金屬離子、亞鐵血紅素(hemes)、黃素(flavins)和吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone,PQQ)[1-2]。亞鐵血紅素依賴的單加氧酶也被稱為細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,CYPs)或P450s(EC 1.14.13-15.x)，在許多生物體中都存在，包括真核生物(哺乳類動物、植物和真菌)和原核生物(藍(lán)細(xì)菌、細(xì)菌、放線菌、螺旋體和支原體)[3]。它們的命名源于還原態(tài)亞鐵血紅素和CO結(jié)合后在450 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收。這一特殊的強(qiáng)吸收峰也被用來測定CYPs的濃度[4]。P450單加氧酶可以催化多種氧化反應(yīng)，包括未活化C—H鍵的羥化、硫醚的氧化、烯烴環(huán)氧化和O-脫烷基化，并具有較高的化學(xué)、區(qū)域及立體選擇性。這類酶通常具有還原酶結(jié)構(gòu)域和氧化酶結(jié)構(gòu)域，并呈現(xiàn)不同的拓?fù)涮卣?。典型的代表就是單一組分的P450BM3，而CYP116B亞家族中的單加氧酶，其氧化還原伴侶與氧化酶結(jié)構(gòu)域也融合在單一肽鏈上，依據(jù)新穎的還原伴侶可以實(shí)現(xiàn)電子的自給自足。目前，通過蛋白質(zhì)進(jìn)化這類酶已經(jīng)可以有效催化特殊的反應(yīng)，例如反馬氏加成反應(yīng)。本文中，筆者主要從CYP116B家族單加氧酶的發(fā)現(xiàn)、表征、分子改造及結(jié)構(gòu)功能關(guān)系等方面綜述了CYP116B在生物催化領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)研究者提供參考。

1 P450單加氧酶的分類

CYPs被發(fā)現(xiàn)以來得到了廣泛關(guān)注和深入研究，而其分類方法也有許多種。目前，被廣泛認(rèn)可的1種分類方法是基于其電子傳遞系統(tǒng)的不同，將CYPs分為典型的5類[5]，如圖1所示。

圖1 P450單加氧酶基于氧化還原配體的分類[5]Fig.1 Classification of P450 monooxygenases based on the redox parters[5]

ClassⅠ為三組分體系，存在于大部分細(xì)菌和線粒體中。3個組分包括含有Fe-S簇的鐵氧還蛋白(ferredoxin,Fdx)、含有FAD的鐵氧還蛋白還原酶(ferredoxin reductase,FdR)和含有亞鐵血紅素(heme)的P450氧化酶。其中，在Fdx中的Fe-S簇種類繁多，包括[2Fe-2S]、[3Fe-4S]和[4Fe-4S]等。在反應(yīng)過程中，由FdR將電子從NAD(P)H傳遞給Fdx，F(xiàn)dx再將電子傳遞給P450氧化酶。ClassⅠ家族CYPs的典型代表為來自惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的P450cam-Pdx-PdR[6-7]。

ClassⅡ和ClassⅢ存在于大部分真核生物微粒體和某些細(xì)菌中。以含有輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)的NAD(P)H細(xì)胞色素P450還原酶(NAD(P)H cytochrome P450 reductase,CPR)作為電子傳遞蛋白。其中，ClassⅡ存在于真核生物中，該電子傳遞蛋白結(jié)合在細(xì)胞膜上，在反應(yīng)過程中，由CPR將電子從NAD(P)H傳遞給P450氧化酶[8]。ClassⅢ存在于細(xì)菌中，只有1條融合的可溶性多肽鏈，該多肽鏈含有雙功能結(jié)構(gòu)域，即含有血紅素輔基heme的P450酶結(jié)構(gòu)域和含有輔因子FAD和FMN的雙黃素還原酶結(jié)構(gòu)域，2個結(jié)構(gòu)域之間由一段短的蛋白質(zhì)連接肽(linker)連接。在反應(yīng)過程中，不需外加輔助的電子傳遞蛋白，電子即可在分子內(nèi)部傳遞，是1種電子自給自足的催化體系。這一特征也使得ClassⅢ家族的CYPs電子傳遞效率更加高效，從而促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。其典型代表為來自巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)的P450BM3[9]。

Class Ⅳ是一種單組分的CYPs體系，該家族的CYPs含有和ClassⅠ相同的組分，但區(qū)別在于該家族CYPs中的3個組分和ClassⅢ家族一樣在1條融合的多肽鏈上。最初發(fā)現(xiàn)于紅球菌Rhodococcussp.NCIMB 9784(CYP116B2或P450Rhf)，筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中篩選到的紅球菌(Rhodococcussp.)ECU0066[10]中克隆得到1個硫醚單加氧酶P450SMO[11]，它和P450Rhf的序列一致性為73%，并且對一系列硫醚底物具有良好的催化活力及立體選擇性。

ClassⅤ是一種不常見的CYPs，存在于一些真菌中，一氧化氮還原酶(P450nor)參與反硝化反應(yīng)[12]。

2 CYP116B家族酶的特征和發(fā)掘

2.1 CYP116B家族單加氧酶的特征

CYP116B家族單加氧酶屬于第 Ⅳ 類單加氧酶，含有和第 Ⅰ 類相同的組分，即包括含有Fe-S簇的鐵氧還蛋白(Fdx)，含有FAD的鐵氧還蛋白還原酶(FdR)和含有亞鐵血紅素(heme)的P450氧化酶，但區(qū)別在于該家族的CYPs中3個組分和第 Ⅲ 家族一樣在1條融合的多肽鏈上。在此體系中，N端的P450功能域與含輔因子FMN的還原酶功能域相連，再與C端的鐵硫蛋白相連，其電子傳遞路徑與第 Ⅲ 類酶類似，也是在蛋白分子內(nèi)部完成。首先，NADPH和還原酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并將電子傳遞給輔因子FMN，然后還原態(tài)的FMN將電子轉(zhuǎn)移給Fe2S2中心，F(xiàn)e2S2中心最后將電子轉(zhuǎn)移給heme結(jié)構(gòu)域的卟啉環(huán)。但是由于直至目前尚無該家族CYPs的蛋白結(jié)構(gòu)報道，所以其不同結(jié)構(gòu)域之間電子傳遞過程的細(xì)節(jié)尚未知。

2.2 CYP116B單加氧酶的發(fā)掘

由于新穎的氧化還原伴侶與氧化酶結(jié)構(gòu)域融合在單一肽鏈上，所以CYP116B亞家族中的單加氧酶可以實(shí)現(xiàn)電子的自給自足，其氧還伴侶包含特殊的FMN和Fe2S2，為整個P450系統(tǒng)提供相應(yīng)的還原力，如圖2所示。

圖2 細(xì)胞色素P450116B亞家族成員酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.2 The topology structure of CYP116B monooxygenase

目前，已經(jīng)報道的該家族成員包括：CYP116B1[13]、CYP116B2(P450RhF)[14]、P450SMO[11]、CYP116B3[15]、CYP116B4(P450Lamo)[16]、CYP116B5[17]、P450RpMO、P450ArMO、P450CtMO[18]，CYP116B62[19]以及耐熱成員CYP116B29、CYP116B46、CYP116B63、CYP116B64和CYP116B65[20]，如表1所示。

表1 已報道的CYP116B單加氧酶舉例

筆者所在課題組從2009年起開展了對CYP116B家族單加氧酶的發(fā)現(xiàn)及合成應(yīng)用方面的研究工作，發(fā)現(xiàn)了包括P450SMO和P450LaMO在內(nèi)的多個酶。最早是針對小分子硫醚類底物，從土壤中篩選到了1株紅球菌Rhodococcussp.ECU0066，它不僅能夠高對映選擇性地將硫醚氧化成手性亞砜，而且還可以對外消旋的手性亞砜進(jìn)行對映體拆分[10]。從紅球菌Rhodococcussp.ECU0066中通過染色體步移技術(shù)克隆得到起催化作用的關(guān)鍵酶P450SMO[11]。以P450SMO為模板，從基因組文庫中挖掘得到了一系列CYP116B家族單加氧酶成員，其中來自LabrenziaaggregataIAM 12614的P450LaMO展現(xiàn)出優(yōu)異的催化特性，底物譜研究表明P450LaMO不僅表現(xiàn)出羥化和環(huán)氧化活力，而且具有脫烷基和不對稱亞砜化活力[16]。通過指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)P450LaMO對以1,2,3,4-四氫萘為核心結(jié)構(gòu)的衍生物具有較高的催化活性[18]。

3 CYP116B單加氧酶催化的反應(yīng)

目前為止，CYP116B亞家族成員酶可以催化反應(yīng)的類型主要包括羥化[14,16]、硫醚氧化[11]、O-脫烷基[13]、N-脫烷基[13]和環(huán)氧化[14,16]等，如圖3所示。催化的底物也主要是苯衍生物以及烷烴類化合物。對于單萜類、多萜類以及甾體類底物并沒有表現(xiàn)出比較好的活力。目前還沒有報道這類酶的天然底物。典型代表來源于紅球菌(Rhodococcussp.)的P450RhF和來源于團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenziaaggregata)的P450LaMO可以催化多種苯衍生物的氧化功能化，表現(xiàn)出比較好的底物特異性。特別是P450LaMO可以催化多個氧化反應(yīng)，包括羥化反應(yīng)、烯烴環(huán)氧化、脫烷基化和硫醚氧化反應(yīng)。

圖3 CYP116B 亞家族成員酶催化反應(yīng)的類型Fig.3 Biocatalytic reactions types of CYP116Bmonoxygenases

3.1 羥化反應(yīng)

P450LaMO催化苯基烷類底物的羥化反應(yīng)(圖4)，產(chǎn)物多為S-構(gòu)型的醇，但是對映選擇性88%～99%，轉(zhuǎn)化率24%～40%。同時，反應(yīng)過程中會有過氧化副產(chǎn)物酮生成。反應(yīng)過程中存在的問題是轉(zhuǎn)化效率不高，對映選擇性也沒有高至99%[16]，所以需要通過分子進(jìn)化進(jìn)一步提高其活力和對映選擇性。

圖4 P450LaMO催化苯基烷類底物的羥化反應(yīng)[16]Fig.4 Hydroxylation of alkylbenzenescatalyzedby P450LaMO[16]

3.2 脫烷基反應(yīng)

這類酶中多數(shù)成員酶可以催化O-脫烷基反應(yīng)。P450LaMO對于對硝基苯甲醚具有很好的催化活力，相比于7-甲氧基香豆素，P450LaMO對7-乙氧基香豆素的催化活力更高。當(dāng)引入雜原子時，脫烷基活力下降明顯。說明脫烷基活力受到非烷基部位電負(fù)性的影響，具體如圖5所示。脫烷基活力常?？梢宰鳛槠渌趸磻?yīng)的指示反應(yīng)。

3.3 烯烴環(huán)氧化反應(yīng)

P450LaMO催化烯烴環(huán)氧化的同時也有反馬氏加成的產(chǎn)物生成。轉(zhuǎn)化率40%～77%，化學(xué)選擇性均小于20%，具體如圖6所示。該反應(yīng)是自然界不存在的反應(yīng)，美國Arnold課題組的Hammer等[22]利用隨機(jī)突變與迭代飽和的突變方式使其化學(xué)選擇性明顯提高(圖7)，這是之前的天然酶所不能實(shí)現(xiàn)的，同時也說明定向進(jìn)化可以讓化學(xué)上難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)成為可能，這也進(jìn)一步拓寬了P450單加氧酶應(yīng)用的范圍。

圖5 P450LaMO催化醚類底物的O-脫烷基反應(yīng)[16]Fig.5 O-dealkylation of etherscatalyzed by P450LaMO[16]

圖6 P450LaMO催化的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)[16]Fig.6 Alkene epoxidation catalyzed by P450LaMO[16]

圖中各百分?jǐn)?shù)是反馬加成產(chǎn)物的比例； *代表其主產(chǎn)物是環(huán)氧化物，有少量烯丙位氧化副產(chǎn)物(<8%)；?代表其主產(chǎn)物是環(huán)氧化物，有少量烯丙位氧化副產(chǎn)物(<1%)圖7 P450LaMO催化的烯烴反馬氏加成反應(yīng)[16]Fig.7 Anti-Markovnikov addition catalyzed by P450LaMO[16]

3.4 硫醚氧化反應(yīng)

P450LaMO催化這類底物的反應(yīng)相對于另外幾類反應(yīng)有較高的轉(zhuǎn)化活力。對映選擇性70%～99%，轉(zhuǎn)化率58%～98%，并且反應(yīng)產(chǎn)物的構(gòu)型均為S-構(gòu)型，如圖8所示。手性產(chǎn)物受到基團(tuán)電負(fù)性的影響，當(dāng)基團(tuán)為供電子基團(tuán)時，其轉(zhuǎn)化率要低于吸電子基團(tuán)的化合物。當(dāng)基團(tuán)為噻吩基時，轉(zhuǎn)化率下降為70%。

圖8 P450LaMO催化的硫醚氧化反應(yīng)[16]Fig.8 Sulfoxidation catalyzed by P450LaMO[16]

在這個酶表征的過程中發(fā)現(xiàn)，P50LaMO展現(xiàn)出一定的催化多樣性，也為后續(xù)的分子改造提供了非常好的模板，通過分子進(jìn)化可以使酶的性能朝著設(shè)計(jì)需要的方向進(jìn)行。

4 CYP116B單加氧酶的分子改造

在蛋白結(jié)構(gòu)未知的情況下，進(jìn)行理性的分子改造顯得比較困難。同時由于這類酶對于非天然底物的活力不高，所以這使得建立針對活力低突變庫的高通量篩選方法變得不是很容易。目前關(guān)于CYP116B亞家族成員酶蛋白質(zhì)改造的報道還較少。2010年，Urlacher課題組的Liu等[23]對CYP116B3脫烷基的活力進(jìn)行改造，因?yàn)樾枰岣叩氖菍?-乙氧基香豆素的脫乙基活力，可以直接利用熒光方法進(jìn)行高通量篩選。主要是在heme部分進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選的結(jié)果是脫乙基活力提高了240倍，效果非常明顯。2017年，Arnold課題組的Hammer等[22]報道了定向進(jìn)化P450LaMO高選擇性地實(shí)現(xiàn)反馬氏加成反應(yīng)，產(chǎn)物是苯基環(huán)氧乙烷和苯乙醛。利用Purpald染料與苯乙醛特征性的顯色進(jìn)行高通量篩選，篩選的最終結(jié)果是活力提高了38倍，化學(xué)選擇性也提高至82%。筆者所在課題組的Li等[24]以P450LaMO為模型采用跨域重組(transdomain combination mutation,TDCM)策略提高其催化四氫萘衍生物的電子偶合效率和比活力，如圖9所示。通過將全長蛋白近似均分為2個部分，分別為氧化酶結(jié)構(gòu)域和還原酶結(jié)構(gòu)域，引入突變到對2個結(jié)構(gòu)域并分別建立NBT-PMS的顯色高通量篩選方法和7-乙氧基香豆素的熒光方法進(jìn)行篩選。最終，通過重疊延伸將2個部分的點(diǎn)引入到突變體中實(shí)現(xiàn)催化性能的改善，最終電子偶合效率提高9.1倍左右，轉(zhuǎn)化頻率提高10倍。

為了提高P450LaMO的對映選擇性，我們設(shè)計(jì)針對底物性質(zhì)的改造策略，即以苯丙氨酸掃描為基礎(chǔ)的迭代飽和突變實(shí)現(xiàn)四氫萘醇對映選擇性的提高和產(chǎn)物選擇性的提高[25]。利用相應(yīng)的選擇性篩選方法(圖10)以提高其選擇性，最終的突變體對映體選擇比為98∶ 2，產(chǎn)物選擇性為99∶ 1，說明這一策略可以用于選擇性的提高。

圖9 跨域重組分子改造P450LaMO[25]Fig.9 Protein engineering P450LaMO based on transdomain combination mutagenesis[25]

CPCR為來源于Candida parapsilosis的脫氫酶；SCO2為來源于Streptomyces coelicolor的脫氫酶圖10 P450LaMO對映選擇性的篩選方法[25]Fig.10 Enantioselectivity screening assay of P450LaMO[25]

5 總結(jié)及展望

這類酶的催化混亂性為其定向進(jìn)化提供了良好的模板[21]，甚至可以作為除P450BM3之外的又一代表性P450單加氧酶。隨著基因工程的快速發(fā)展，多個CYP116B家族成員被克隆表達(dá)，酶的獲得已不再是限制其應(yīng)用的主要因素。將CYP116B進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的限制性因素主要還是其穩(wěn)定性和催化活力?；诰w結(jié)構(gòu)的底物譜拓展以及操作穩(wěn)定性的分子改造，都將會為今后CYP116B的深入研究提供有力的支撐。同時，這類酶具有催化非天然反馬氏加成反應(yīng)的潛能，因此可以作為探索更多新反應(yīng)的重要研究對象。