大腸桿菌微細胞工廠生產(chǎn)萜類化合物研究進展

王崇龍,曹智欽，覃小華，李郁梅，衛(wèi)功元

(蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院， 江蘇 蘇州 215123)

萜類化合物(terpenoids)是自然界中種類龐大、結構復雜多樣的天然產(chǎn)物,已鑒定的種類超過50 000 種。其中，許多種類具有特殊的生理功能或極高的經(jīng)濟價值,因而被開發(fā)利用,如用作抗腫瘤和消炎止痛的藥物、高級香料、環(huán)保殺蟲除草劑等[1]?，F(xiàn)在，隨著化石能源資源枯竭和人們環(huán)境變化的關注日益加強，研究人員積極尋求新能源以替代傳統(tǒng)的化石能源。許多萜烯(烴)具有媲美汽油、重油和航空燃油的物理和化學特性，被認為是可直接替代傳統(tǒng)化石燃料的新一代生物燃料。異戊二烯(isoprene)半萜更是可以直接用來生產(chǎn)天然橡膠的基質原料。因此，萜類化合物涉及醫(yī)藥、環(huán)境、農(nóng)業(yè)和能源等領域，在人類健康生活和生產(chǎn)活動中發(fā)揮著重要作用。

然而，萜類化合物作為次生代謝產(chǎn)物，在天然原料(如植物體)中的含量極其有限。例如，抗瘧藥物青蒿素(artemisinin)的含量僅為青蒿(ArtemisiaannuaL.)葉片干質量的0.1%～1%[2]；1株100年樹齡的紅豆杉(Taxusbrevifolia)僅可提取約260 mg泰素，而治療1個癌癥病人約需要消耗2～4株此種珍稀植物[3-4]。因此，從天然原料中萃取分離萜類化合物的產(chǎn)量難以滿足市場需求，使得供需關系失衡。此外，這種“殺雞取卵式”的生產(chǎn)方式會消耗大量現(xiàn)存的珍稀生物資源，造成不可挽回的生態(tài)危機。直接化學合成法又因萜類化合物本身結構的復雜性，使得化學合成步驟非常繁瑣，且得率極低。例如，泰素從頭化學合成需要經(jīng)過35～51個步驟，最高得率僅為0.4%[3]。如此低的產(chǎn)量不能滿足社會對大宗原料物質(如生物能源等)的需求。模式微生物大腸桿菌(Escherichiacoli)具有生長周期短、遺傳背景清晰、遺傳操作簡單成熟和易于擴大化培養(yǎng)等優(yōu)點，同時，現(xiàn)在新技術(如親和膜法)的發(fā)展使得有效去除內(nèi)毒素技術日臻成熟。因此，開發(fā)大腸桿菌微細胞工廠，利用廉價的碳源或培養(yǎng)基生產(chǎn)此類具有高附加值和廣泛用途的萜類化合物，被認為是一條可持續(xù)發(fā)展的替代途徑，受到生物工程師的青睞[5-6]。

近年來，越來越多的萜類合成路徑得以從植物、細菌和真菌等物種中解析，伴隨著合成生物學(synthetic biology)和代謝工程(metabolic engineering)技術的發(fā)展[7-8]，在大腸桿菌中重構萜類合成通路和工程化改造取得了顯著成效，極大地提高了萜類化合物的合成積累能力。這為進一步深入研究萜類化合物的生物合成和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好基礎。微生物工廠生產(chǎn)萜類，其產(chǎn)量主要依賴于尋找高效的萜類合成酶，增加前體物的合成供應，代謝通量的調(diào)節(jié)及細胞底盤的編輯等[9-10]。

本文中，筆者對基本結構單元異戊二烯焦磷酸(IPP)和其異構體雙甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)主干合成途徑(stem pathway)以及多樣性萜類化合物的枝端合成途徑(branch pathway)進行綜述，總結近幾年來搭建大腸桿菌微細胞工廠生產(chǎn)各類萜類化合物所采用的優(yōu)化策略，展望合成生物學和代謝工程領域新興技術的可能方向，為理性設計大腸桿菌微細胞工廠提供借鑒，推動最終實現(xiàn)萜類化合物的高效高產(chǎn)和工業(yè)化。

1 萜類化合物的合成途徑解析

1.1 IPP和DMAPP基本結構單元的合成途徑

盡管萜類化合物有著復雜多樣的結構，它們均起始于2個五碳(C5)的基本結構單元IPP和DMAPP。自然界中存在2條主要的IPP/DMAPP合成途徑(圖 1)：2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑，主要存在于原核生物及植物質體中；甲羥戊酸(MVA)途徑，主要存在于真核生物和少量細菌中[11-12]。

圖1 合成IPP和DMAPP前體的MEP通路和MVA通路及相關酶Fig.1 MEP and MVA pathways for precursor synthesis of IPP and DMAPP,and associated enzymes

在MEP途徑中，5-磷酸脫氧木酮糖(DXP)合成酶(Dxs)利用焦磷酸硫胺素(TPP)作為輔因子，首先縮合糖酵解中間產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸(G-3-P)和丙酮酸(pyruvate)生成 DXP；進而在NADPH存在的條件下，經(jīng)DXP還原異構酶(Dxr)催化還原生成MEP(此合成途徑也因而以該重要的中間產(chǎn)物命名)。此兩步催化反應被認為是MEP途徑中最為重要的限速反應。隨后，在2-甲基赤蘚醇磷酸胞苷?；D移酶(IspD)的催化下，MEP與CTP相作用生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖醇(CDP-ME)；CDP-ME激酶(IspE)利用ATP將CDP-ME磷酸化生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖-2-磷酸(CDP-MEP)；CDP-MEP再經(jīng)過2-C-甲基赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸(MEcPP)合成酶(IspF)的催化作用，裂解和環(huán)化生成MEcPP并釋放出CMP。最后，MEcPP經(jīng)(反)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸(HMBPP) 合成酶(IspG)還原催化作用開環(huán)生成HMBPP，經(jīng)HMBPP還原酶(IspH)對HMBPP進一步還原，按約1∶ 5的摩爾比生成DMAPP 和IPP。此外，IPP/DMAPP異構酶(IDI)可以催化實現(xiàn)2種異構體之間的轉換。

在MVA途徑中，3分子起始底物乙酰輔酶A(acetyl-CoA)在硫解酶(THL)和β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)的催化下生成HMG-CoA,HMG-CoA還原酶(HMGR)在NAPDH存在的情況下催化還原HMG-CoA生成MVA。此還原步驟是一個不可逆反應和MVA合成的限速反應。接著，MVA在ATP存在的情況下被MVA激酶(MK)磷酸化其5′-OH位，生成甲羥戊酸-5-磷酸(MVA-5-P)，繼續(xù)被MVA-5-P激酶(PMK)催化生成甲羥戊酸-5-焦磷酸(MVA-PP)，最后在MVA-PP脫羧酶(DPMD)作用下發(fā)生脫羧并雙鍵化生成IPP。IPP/DMAPP異構酶IDI 催化IPP的異構生成DMAPP。該經(jīng)典MVA途徑中的酶系組成和各酶的功能研究已經(jīng)比較透徹。然而，最近的研究表明某些古生菌(Archaea)中可能存在異于該經(jīng)典MVA途徑的合成旁路[13-14]。在沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferaxvolcanii)中，MVA-5-P可能先經(jīng)過MVA-5-P脫羧酶(PMD)脫羧作用生成異戊二烯磷酸(IP)，再經(jīng)過IP激酶(IPK)磷酸化生成IPP。在嗜酸熱原體菌(Thermoplasmaacidophilum)中，MVA的磷酸化由甲羥戊酸3-激酶(M3K)催化，在MVA的3′位羥基發(fā)生磷酸化，生成甲羥戊酸3-磷酸(MVA-3-P),繼續(xù)由甲羥戊酸-3-磷酸5-激酶(MVA-3-P 5-kinase)在其5′-OH位磷酸化生成甲羥戊酸-3,5-雙磷酸(MVA-3,5-BP),最后經(jīng)由MVA-5-P脫羧酶PMD和IP激酶催化生成IPP。

1.2 萜類化合物的枝端合成途徑

主干途徑顯示為棕黃色，枝端途徑顯示為灰色，可分為各類萜烯母核分子合成(淺綠色)和多種母核修飾途徑(淺藍色)兩層圖2 萜類化合物生物合成路線示意Fig.2 Scheme of biosynthesis routs of terpenoids

基本結構單元DMAPP和IPP是所有萜類的共同前體。1分子DMAPP在相應異戊二烯焦磷酸合成酶的催化作用下，聚合不同分子數(shù)量的IPP形成香葉基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)等。接著，這些焦磷酸中間體再經(jīng)過不同的萜類合成酶(TPS)催化發(fā)生脫磷、環(huán)化和羥化反應,生成結構各異的萜類烯烴(olefins)和烯烴醇(圖2)。依據(jù)所含C5基本結構單元的數(shù)量，劃分為半萜烯(hemiterpenes,C5)、單萜烯(monoterpenes,C10)、倍半萜烯(sesquiterpenes,C15)和雙萜烯(diterpenes,C20)。另外，2分子FPP以頭對頭的方式經(jīng)鯊烯合成酶(SQS)催化合成鯊烯(C30)；也可以經(jīng)脫水鯊烯合成酶(DSQS)合成脫水鯊烯，再經(jīng)脫水鯊烯去飽和酶(DSQD)合成4,4′-四神經(jīng)孢子(4,4′-diaponeurosporene,C30)——C30類胡蘿卜素類(C30 carotenoids)化合物的前體。同樣，2分子GGPP以相同的方式經(jīng)八氫番茄紅素合成酶(PHS)催化合成八氫番茄紅素，再經(jīng)八氫番茄紅素去飽和酶(DSQD)生成番茄紅素(lycopene,C40)——C40類胡蘿卜素類化合物和維甲類物質(retenoids，C20)的前體。以這些酶構建萜類化合物的枝端合成途徑可以合成各類在結構層面多樣的萜類化合物骨架母核(圖2)。進而，這些母核分子還可以經(jīng)過羥基化、環(huán)氧化、糖基化和鹵化等多種修飾作用，形成種類更加豐富的、生物活性趨向更加多樣化的各類物質。氧化是萜類化合物修飾中最常見的方式，多數(shù)情況下通過細胞色素P450氧化酶系(CYPs)進行單加氧反應[15]。例如，檸檬烯(limonene)由檸檬烯-6-羥化酶催化在6位發(fā)生催化生成香芹醇(carveol)；黃花蒿CYP71AV1能催化紫穗槐二烯(amorphadiene)到青蒿酸(artenisinic acid)的多步氧化；鯊烯能在鯊烯環(huán)氧酶(squanlene epoxidase)的催化下生成環(huán)氧鯊烯(2,3-oxidosqualene)。

2 大腸桿菌代謝工程合成萜類化合物

2.1 MEP通路的代謝工程

大腸桿菌利用其固有MEP途徑合成IPP和DMAPP 2種基本結構單元。該內(nèi)源通路可能在轉錄、翻譯及翻譯后多個水平進行嚴格調(diào)控[16]，然而其調(diào)控機制尚未完全闡明。MEP通路的8個基因(包括idi)分散在基因組的7個不同座位。最普遍的調(diào)控策略是通過MEP通路限速酶(如Dxs、Dxr和Idi等)的過表達以提高前體物IPP和DMAPP的合成。例如，通過表達并優(yōu)化Dxs、Dxr和Idi這3個酶在載體上的表達順序，將異戊二烯絕對生產(chǎn)強度從0.47 mg/(g·h)(以1克細胞干質量計)提高到2.73 mg/(g·h)[17]。將Dxs、Idi、IspD和IspF這4個酶模塊化，通過啟動子及拷貝數(shù)的改變調(diào)控MEP通路，同時結合調(diào)控紫杉二烯合成模塊的表達優(yōu)化，該紫杉醇前體物的產(chǎn)率近1.0 g/L[3]。與利用載體過表達限速酶相比，研究者們也嘗試了直接調(diào)控大腸桿菌內(nèi)源限速酶的表達。通過無痕編輯dxs和idi基因與啟動子間的核糖體結合區(qū)(RBS)，β-胡蘿卜素工程菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素的產(chǎn)率提升了2.5倍，從1.53 mg/g提升到5.33 mg/g(以1 g細胞干質量計)。進一步加強β-胡蘿卜素模塊的表達，調(diào)節(jié)限速酶Dxr和Idi,強化表達水平,提升IPP和DMAPP合成前體的能力，最終β-胡蘿卜素產(chǎn)率達到18.4 mg/g[18]。

MEP通路利用糖酵解途徑中的G-3-P和丙酮酸為底物，并按1∶ 1的摩爾比起始合成，而2種底物在大腸桿菌代謝網(wǎng)絡中的濃度與此要求有較大差異。早期的研究表明，通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc)或者合成酶(Pps)過表達使得代謝流從丙酮酸向G-3-P逆向，此策略平衡了MEP通路2個起始底物的比例，將工程菌產(chǎn)番茄紅素的量提高了3～5倍[19]。最近的研究將底物的來源途徑從糖酵解途徑轉換為Entner-Doudoroff(ED)途徑和戊糖磷酸(PPP)途徑，使得工程菌利用MEP途徑合成萜類的效率呈數(shù)倍提高[20-21]。

MEP通路的激活還需要輔因子ATP和NADPH的參與。合適的NADPH氧化還原狀態(tài)和濃度是維持Dxr、IspG和IspH活性，提高MEP通路合成效率的重要保障。過表達黃素氧還蛋白(FldA)及其還原酶(Fpr)和NAD激酶使得工程菌通過MEP通路合成原伊魯烯(protoilludene)的產(chǎn)量提升6.6倍，從67.4 mg/L升至512.7 mg/L[22]。

MEP通路復雜，其調(diào)控體系尚不明晰，而代謝工程的改造需要精確地控制各酶組分的表達，以避免代謝中間產(chǎn)物(如MEcPP)的累積[23-24]。例如，通過平衡IspG和IspH的表達水平，MEcPP的累積得以消除，改造后的工程菌株合成β-胡蘿卜素和番茄紅素的能力提升了70%以上[25]。此外，研究者們嘗試以D-阿拉伯糖為碳源，利用果糖-6-磷酸醛縮酶對糖底物的廣譜活性來合成DXP，為MEP通路提供新的底物[26]。隨著對MEP通路調(diào)控理解的加深，通過此通路合成萜類化合物一定會獲得更大的進步。

2.2 MVA通路的代謝工程

異源表達MVA通路是一條被廣泛接受的策略，通過促進IPP和DMAPP的供給，從而在大腸桿菌中提升萜類產(chǎn)量。伯克利大學杰伊·凱斯林(Jay Keasling)研究組首先將此通路引入大腸桿菌中來提升青蒿素前體紫穗槐二烯(amorphadiene)的產(chǎn)量[27]，為很多研究組通過編輯此通路在大腸桿菌中合成多種萜類物質提供了范例。通過RBS起始蛋白質的翻譯強度，優(yōu)化MVA通路各組分的表達水平，使得紫穗槐二烯產(chǎn)量達到3.6 g/L的水平。還有以變更啟動子、載體拷貝數(shù)及同源基因替換的策略來調(diào)節(jié)MVA通路合成IPP和DMAPP，成功獲得多種萜類產(chǎn)物[28-30]。然而，MVA通路的過于上調(diào)或者萜類產(chǎn)物合成與IPP和DMAPP供給的失調(diào)，往往會造成IPP/DMAPP及其他焦磷酸中間產(chǎn)物的累積，產(chǎn)生細胞毒性，影響到工程菌合成萜類產(chǎn)物的能力。與這些靜態(tài)調(diào)控策略相比，研究者們也發(fā)明出了一些巧妙的策略來動態(tài)調(diào)控MVA通路合成IPP和DMAPP[31]。例如，法尼基焦磷酸(FPP)應答型啟動子可以敏銳地反饋細胞內(nèi)FPP的濃度水平，從而調(diào)節(jié)FPP的合成水平，并使之向紫穗槐二烯轉化，這使得產(chǎn)物的產(chǎn)量比靜態(tài)調(diào)控的產(chǎn)量翻番，搖瓶培養(yǎng)達到1.2 g/L的水平[32]；相同的策略使得工程菌產(chǎn)β-胡蘿卜素達到23 mg/g的水平[33]。通過群集效應系統(tǒng)感知種群密度來控制整個合成通路的表達水平，促使工程菌能合成1.1 g/L紅沒藥烯[34]。

MVA通路的調(diào)節(jié)具有更強的魯棒性，雖然調(diào)控的精度較低，但是對底盤細胞的適應性比MEP通路要強。通過補料分批培養(yǎng)，紅沒藥醇產(chǎn)量達到了9.1 g/L[35]；結合通氣回收，補料分批培養(yǎng)異戊二烯的產(chǎn)量可達到60 g/L[36]。

MVA通路的一些旁路途徑的發(fā)現(xiàn)可以豐富MVA通路的代謝改造策略，例如,IP中間產(chǎn)物可以直接用來脫磷生成異戊二烯醇，以縮短合成路線，提高合成效率[37]。從化學計量學的角度來看，利用MVA通路從碳源(如葡萄糖)合成IPP和DMAPP是1個多余的合成NADH還原力的過程，進而表現(xiàn)出碳源利用的低經(jīng)濟性；而利用MEP通路進行合成則是一個高經(jīng)濟性的過程，但需要額外的還原力，耦聯(lián)這2條通路，可達到碳源和能量的平衡態(tài)，補料分批發(fā)酵此工程菌株可產(chǎn)出24 g/L異戊二烯，產(chǎn)率達到0.267 g/g(以1 g葡萄糖質量計)[38]。

2.3 枝端合成途徑的代謝工程

在優(yōu)化MEP和MVA途徑、建立IPP和DMAPP供給平臺的情況下,引入不同的枝端萜類合成通路就可實現(xiàn)目標萜類產(chǎn)物在大腸桿菌中的合成。迄今為止，數(shù)以千計的植物、真菌或細菌來源的萜烯合成酶信息已收錄在數(shù)據(jù)庫中，這為大腸桿菌合成不同的萜類產(chǎn)物提供了可能。事實上，如前所述的許多案例也證明了這一點。萜類在自然界中作為次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量極低，這可能是萜烯合成酶的催化活性(kcat)偏低，因而不能高效高產(chǎn)萜類化合物。萜烯合成酶盡管在蛋白質序列上表現(xiàn)出很大的差異，但是它們都共享1個多α-螺旋骨架結構和極度保守的催化結構域，因此，研究者們得以理性設計和/或隨機進化來編輯萜烯合成酶，提升其催化活性。例如，以理性設計法高通量篩選獲取的蒎烯(pinene)合成酶合成蒎烯的能力提升了1倍；對左旋海松二烯合成酶催化域進行理性設計，其合成能力提升了10多倍[39]。

萜烯合成酶類除表現(xiàn)出專一產(chǎn)物的合成活性外，還有相當一部分具有合成多種產(chǎn)物的廣譜活性。以此特性為藍本，萜烯合成酶可以按照需求進行定制[40]，或通過改變其底物的供給來合成不同的產(chǎn)物[41]。各種萜基焦磷酸中間產(chǎn)物可經(jīng)脫磷直接合成萜基生物燃料，因為萜類的結構重排沒有特殊要求。因此，很多研究組在挖掘現(xiàn)有磷酸酶對萜基焦磷酸脫磷新功能方面進行了很多嘗試。大腸桿菌磷脂酸甘油磷酸酶PgpB和YbjG可對FPP進行脫磷繼而合成法尼醇[42]。Nudix水解酶家族成員NudB、NudF對IPP和DMAPP表現(xiàn)出很強的水解脫磷活性[43-44]，利用NudB大腸桿菌工程菌株可在搖瓶培養(yǎng)條件下合成2.2 g/L異戊二烯醇[45]。

對萜烯母核進行修飾合成更具生物活性的萜類產(chǎn)物方面有待更進一步的研究。細胞色素P450和其還原酶伴侶分子相融合能提高P450對萜烯的加氧活性[46-47]，以克服大腸桿菌本身低下的加氧修飾能力及不利的合成環(huán)境。此外，多菌聯(lián)合培養(yǎng)過程(consortia process)整合各自的生產(chǎn)特性或許是一條值得嘗試的策略[48]。

2.4 大腸桿菌細胞底盤代謝工程

系統(tǒng)生物學研究使得在多重組學(omics)水平上解析宿主代謝網(wǎng)絡和外源通路相互應答，進而加深底盤代謝網(wǎng)絡理解，為最終提升萜類或其他化合物產(chǎn)量提供保障[49-51]。在大腸桿菌中合成親脂性萜類物質，需要轉運到胞外或者存儲到細胞膜上。分子量小的二萜(≤C20)等可以通過兩相雙層培養(yǎng)的方式將合成產(chǎn)物原位萃取到胞外有機相[52]，其通過膜通道轉運蛋白進行轉運的途徑也取得進展[53-54]；然而，三萜、四萜產(chǎn)物卻很難通過兩相雙層培養(yǎng)萃取到有機相中再透過細胞膜，對其通過轉運通道蛋白向外轉運也并不理想[55]。研究者試圖通過編輯細胞膜以拓展其存儲空間，例如通過細胞內(nèi)膜的拓展，β-胡蘿卜素的單細胞產(chǎn)量提高2.9倍[56]。大腸桿菌底盤細胞的代謝工程還有很多方面的工作值得人們繼續(xù)深入研究。

3 總結和展望

代謝工程的發(fā)展使微生物合成萜類產(chǎn)物成為可能，并展現(xiàn)出微生物細胞工廠合成此類物質的巨大潛能和優(yōu)勢。通過各種創(chuàng)新性的策略，優(yōu)化主干通路和枝端通路，成功合成了一大批萜類物質。但是與種類紛繁的萜類化合物相比，更多的合成工作亟待挖掘。從合成產(chǎn)能(titer、rate和yield)角度考慮，現(xiàn)有的工程菌株和策略與工業(yè)生產(chǎn)尚存有距離。在大腸桿菌微細胞工廠中大量合成萜類產(chǎn)物必然會打破細胞既有的代謝網(wǎng)絡，將來的研究可能集中在以下四方面：①萜類化合物合成途徑優(yōu)化，如，RBS調(diào)控、通路模塊化、同源酶替換等。②大腸桿菌細胞底盤改造。如，菌株進化、系統(tǒng)生物學代謝網(wǎng)絡解析。③萜類產(chǎn)物的轉運和存儲。如，膜通道轉運蛋白挖掘、膜容積拓展。④萜類母核修飾途徑。如，P450加氧酶編輯、多菌聯(lián)合培養(yǎng)過程等。除對主干和枝端通路進行不斷優(yōu)化外，還需要借助于系統(tǒng)生物學，解析和打造優(yōu)質的大腸桿菌合成底盤，建立改造高效的萜類產(chǎn)物轉運途徑和存儲空間，開發(fā)可行性高的母核分子修飾途徑。我們相信改造大腸桿菌這一研究最為透徹的模式生物必將開創(chuàng)出微生物細胞工廠新局面，為工業(yè)規(guī)模化合成有用萜類物質奠定基礎。