醬油風(fēng)味物質(zhì)檢測方法研究進(jìn)展

陳亮，賀博，康文麗，吳燦，周尚庭

(加加食品集團(tuán)股份有限公司,湖南 長沙, 410600)

醬油起源于中國，已經(jīng)有2 700多年的歷史[1]；它是中國以及亞洲其他國家(如日本、韓國、泰國)乃至世界上比較重要的調(diào)味品之一[2]。醬油香氣的好壞是衡量醬油質(zhì)量的重要感官指標(biāo)之一，因此對醬油香氣的研究引起了很多學(xué)者的關(guān)注。日本是研究醬油香氣最早的國家，有文獻(xiàn)報(bào)道早在1887年就開始研究醬油的香氣[3]，1940年KIHARA在《日本化學(xué)會(huì)志》上發(fā)表了關(guān)于醬油香氣的文章，從醬油中鑒定出來的香氣成分有乙醇、乙酸、乙酸乙酯、麥芽酚、乳酸異戊酯、乳酸、丙交酯[4]。1955年第一臺(tái)商品氣相色譜儀的推出以及其在醬油研究中的應(yīng)用，加速了醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定；到1977年日本學(xué)者就發(fā)表了30多篇關(guān)于醬油風(fēng)味分析的文章，從醬油中鑒定出的揮發(fā)性成分有200多種[5]，至今日本學(xué)者對醬油的風(fēng)味研究也沒有停止[6]。從檢索到的文獻(xiàn)看，我國對醬油的風(fēng)味研究也較早，在1953年就已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了測定醬油中揮發(fā)性酸、酯、醛、乙醇、3-羥基丁酮和2,3-丁二酮的方法[7-8]，到1980年已經(jīng)采用氣相色譜儀研究醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分[9]；隨著氣相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的普及，國內(nèi)關(guān)于醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究從2008年以后開始增多。本文從醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取方法、醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分定性與定量方法、醬油中鑒定出來的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行歸納總結(jié)，指出目前國內(nèi)研究醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分存在的問題，期望對從事醬油風(fēng)味研究的人員有一定的參考價(jià)值。

1 醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取方法

要想對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，首先需要將它們從醬油中提取出來，目前報(bào)道的提取醬油中揮發(fā)性成分的方法有以下幾種。

1.1 溶劑直接萃取

溶劑直接萃取法就是采用溶劑對醬油中的揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取，由于醬油也是液體的，所以該方法在萃取醬油中的揮發(fā)性成分時(shí)也稱為液液萃取，可以直接采用分液漏斗進(jìn)行萃取[10]，也可以采用特制的玻璃儀器進(jìn)行連續(xù)液液萃取[11]，常用的溶劑是乙醚、二氯甲烷或它們的混合物[12-14]；其優(yōu)點(diǎn)是通過選擇溶劑，可以將醬油中的各類揮發(fā)性風(fēng)味成分提取出來；缺點(diǎn)是提取過程中也會(huì)將醬油中的難揮發(fā)或不揮發(fā)性成分(如色素、氨基酸、蠟)提取出來，采用氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用對提取物進(jìn)行分析時(shí)，為了延長色譜柱的使用時(shí)間，需要對提取物進(jìn)一步處理，去除那些難揮發(fā)或不揮發(fā)性成分。趙謀明等采用二氯甲烷為溶劑萃取了2種不同淀粉質(zhì)制得的醬油中的揮發(fā)性成分，提取物經(jīng)過濃縮、有機(jī)膜過濾后進(jìn)行GC-MS分析，從兩種醬油中各鑒定出60種成分[13]。

1.2 同時(shí)蒸餾萃取

同時(shí)蒸餾萃取法是20世紀(jì)70年代由POLLIEN等設(shè)計(jì)的[15]，該方法的優(yōu)點(diǎn)是集蒸餾與萃取于一體，操作簡單，所用溶劑量少；該方法的缺點(diǎn)是不適合提取對熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性成分，同時(shí)由于提取過程中加熱，也會(huì)生成一些樣品中不存在的成分；為了解決這個(gè)問題，可以在減壓條件下進(jìn)行同時(shí)蒸餾萃取，但是采用冷凝效率更高的冷凝器。劉巍等采用常壓同時(shí)蒸餾萃取的方法提取了市售醬油中的揮發(fā)性成分，經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用儀分析，從中鑒定出了50種成分，含量較高的有乙醇、糠醇、苯乙醛等[16]；馮笑軍等采用同時(shí)蒸餾萃取的方法提取了天然釀造醬油與配制醬油中的揮發(fā)性成分，在4種不同工藝生產(chǎn)的醬油中共鑒定出了51種成分，其中釀造醬油中酸、醇、酚、醛酮、酯類物質(zhì)的種類均比配制醬油多，配制醬油中體現(xiàn)烤香的吡嗪類化合物比較豐富，構(gòu)成醬油特征香氣成分的4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醇、糠醛等物質(zhì)的含量在配制醬油中相對含量也較低[17]。泰國學(xué)者采用減壓同時(shí)蒸餾萃取的方法提取了泰式醬油中的揮發(fā)性成分，經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用儀分析，從兩種醬油中鑒定出了53種成分，其中相對含量較高的有異戊醇、乳酸乙酯、苯乙醇、糠醇等[2]；高獻(xiàn)禮等也采用這種方法提取了廣東產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，提取物經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀鑒定出了44種成分[18]。

1.3 吹掃捕集

吹掃捕集法也稱為動(dòng)態(tài)頂空技術(shù)，是用流動(dòng)的惰性氣體將樣品中的揮發(fā)性成分吹掃出來，用一個(gè)捕集器將吹掃出來的揮發(fā)性成分進(jìn)行吸附，然后將被吸附的成分經(jīng)熱解吸送入氣相色譜儀或氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。通過此方法提取得到的成分都是能夠揮發(fā)的，但是由于吹掃效率受到多重因素的影響(吹掃溫度、吹掃氣的流速、吹掃時(shí)間、捕集效率等)，且需要專用的儀器，近年來該方法在提取醬油中的揮發(fā)性成分使用較少。泰國學(xué)者采用該方法提取了泰式醬油中的揮發(fā)性成分，經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用儀分析，從兩種醬油中鑒定出了50種成分，其中相對含量較高的有異戊醇、乙醇、異丁醇、丁醇等[2]；而采用該方法從另外兩種醬油中檢測到27種物質(zhì)，其中18種具有香氣活性[1]。韓國學(xué)者采用該方法研究了韓式醬油在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化情況，共鑒定出62種成分，其中在發(fā)酵的起始階段醇類、酮類、吡嗪類含量較高，隨著發(fā)酵工程的進(jìn)行，酸類和醛類的含量升高[19]。

1.4 溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)

溶劑輔助風(fēng)味成分蒸發(fā)(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)是1999年由德國ENGEL研究團(tuán)隊(duì)發(fā)明的[20]，首先采用溶劑對樣品中的風(fēng)味成分進(jìn)行提取，然后利用高真空系統(tǒng)(壓力為10-5mbar)和低溫冷凝(用液氮)將提取物中的揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分進(jìn)行分離。該方法的優(yōu)點(diǎn)是提取與分離揮發(fā)性成分的過程中沒有對樣品進(jìn)行加熱處理，得到的提取物能真實(shí)反映出樣品中的揮發(fā)性成分組成，目前該方法是國際上公認(rèn)的提取揮發(fā)性成分最好的方法。由于該方法需要使用高真空系統(tǒng)，相對其他提取方法設(shè)備成本較高，國內(nèi)使用較少。德國SCHIEBERLE團(tuán)隊(duì)用乙醚萃取了日本醬油中的風(fēng)味成分，所得提取物經(jīng)SAFE處理得到醬油中的揮發(fā)性成分，所得揮發(fā)性成分經(jīng)過進(jìn)一步處理得到酸性組分和中堿性組分，經(jīng)過氣相色譜-嗅聞儀(gas chromatography olfactometry,GC-O)分析和香氣萃取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis, AEDA)，共鑒定出香氣稀釋因子(FD因子)>于8的香氣活性物質(zhì)有30種[21]。日本學(xué)者用二氯甲烷為溶劑，采用同樣的方法研究了5種市售醬油中的關(guān)鍵香氣成分和生醬油經(jīng)過加熱以后香氣活性物質(zhì)的變化情況，其中從5種市售醬油中鑒定出的關(guān)鍵香氣成分有25種，含量較高的有苯乙醛、異戊酸、麥芽酚、苯乙酸和呋喃酮類成分，醬油經(jīng)過加熱以后4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚的含量增加較多[22-23]。

1.5 固相微萃取

固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)是1989年加拿大Waterloo大學(xué)PAWLINSZYN團(tuán)隊(duì)發(fā)明的，1993年Supelco公司進(jìn)行了固相微萃取裝置的商品化工作，該技術(shù)集萃取、濃縮、解吸、進(jìn)樣于一體，具有操作簡單、樣品用量少、不用溶劑、使用成本低、敏感、快速、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等領(lǐng)域中的提取揮發(fā)性成分[24-25]；但是由于起到萃取作用的纖維對醬油中風(fēng)味物質(zhì)的萃取都具有一定的選擇性，采用不同纖維進(jìn)行萃取時(shí)鑒定出的成分有所不同，定量結(jié)果相差較大。2008年以后開始用于提取醬油中的揮發(fā)性成分，近10年中發(fā)表的關(guān)于醬油中的揮發(fā)性成分的中文文獻(xiàn)中有70%以上(英文有60%以上)用到該方法作為揮發(fā)性成分的提取方法。由于起到萃取作用的是涂在石英絲表面的涂層，而不同材質(zhì)的涂層對揮發(fā)性成分都具有一定的選擇性，所以所得分析結(jié)果與樣品實(shí)際存在的揮發(fā)性成分之間存在一定差別；采用該方法作為揮發(fā)性成分的提取方法進(jìn)行定量時(shí)，如果不采用穩(wěn)定同位素稀釋方法進(jìn)行定量，很難得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果(尤其是面積歸一化法的定量結(jié)果極其不準(zhǔn))。陶文沂團(tuán)隊(duì)采用該方法提取了日本醬油中的揮發(fā)性成分，對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用分析，利用質(zhì)譜定出了97種成分[26]；同時(shí)也對自制的低鹽固態(tài)和高鹽稀態(tài)工藝所得釀造醬油中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了提取與分析[27]。趙謀明團(tuán)隊(duì)也采用了固相微萃取及其他提取方法對發(fā)酵6個(gè)月的醬油中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取與分析，共鑒定出147種成分，其中從固相微萃取所得提取物中鑒定出60多種揮發(fā)性成分[18]；利用固相微萃取提取了低鹽固態(tài)和高鹽稀態(tài)醬油中的揮發(fā)性成分，提取物經(jīng)氣相色譜-嗅聞儀聯(lián)用分析，分別從低鹽固態(tài)和高鹽稀態(tài)醬油中鑒定出33個(gè)和37個(gè)香氣活性區(qū)域，經(jīng)過調(diào)整分流比進(jìn)行AEDA，發(fā)現(xiàn)3-甲基丁醛、苯乙醛和丙酸乙酯在低鹽固態(tài)醬油中有較高的FD因子，而乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和3-甲硫基丙醛在高鹽固態(tài)醬油中有較高的稀釋因子[28]。日本的ETSUKO團(tuán)隊(duì)采用固相微萃取的方法對日本醬油中的果香成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和4-甲基戊酸乙酯具有較高的FD因子，并且2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯的含量較高[29]。

1.6 其他提取方法

除以上常用的提取醬油中的揮發(fā)性成分的方法外，還有蒸餾法和頂空取樣法。

蒸餾法就是通過蒸餾將醬油中的所有揮發(fā)性成分蒸餾出來(包括水)，然后再采用溶劑萃取餾出物中的香氣成分，所得提取物經(jīng)過濃縮后進(jìn)行分析；蒸餾過程可以在常壓下進(jìn)行[30]，也可以在減壓下進(jìn)行[31]，早期研究醬油中的風(fēng)味成分時(shí)也采用先萃取后蒸餾的方法[4]；這種方法既需要蒸餾又需要萃取，且提取過程中需要加熱，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分發(fā)生變化，目前該方法被使用得越來越少。

頂空取樣法在早期分析醬油的揮發(fā)性成分時(shí)使用較多，就是用氣密性注射器抽取頂空中的氣體進(jìn)行分析[9]，主要用于分析醬油中的低沸點(diǎn)呈香物質(zhì)，如乙醛、乙酸甲酯、異丁醛、乙醇、異戊醇、異丁醇、異戊醛和2,3-丁二酮[32]。該方法的缺點(diǎn)是抽取到的頂空氣體中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量低，在進(jìn)行氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用分析時(shí)給出的響應(yīng)值低，不便于定性與定量，逐漸被固相微萃取法所代替；但是該方法與固相微萃取法相比，得到的樣品能真實(shí)地反映頂空氣的組成。隨著冷柱頭進(jìn)樣口的商業(yè)化以及檢測器種類增多與檢測器檢測限的降低，頂空取樣法作為提取揮發(fā)性成分的方法之一再次引起研究人員的重視[33]，頂空自動(dòng)進(jìn)樣裝置技術(shù)成熟也會(huì)推動(dòng)該方法的應(yīng)用[34]。

2 醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分定性與定量方法

采用不同的前處理方法將醬油中的揮發(fā)性成分提取出來以后，就需要對提取物中的成分進(jìn)行定性與定量分析，早期主要采用化學(xué)分析的方法進(jìn)行分析，之后采用氣相色譜儀進(jìn)行分析，如今主要采用氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

定性方法主要包括標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)譜、保留指數(shù)和香氣特征。在4種定性方法中，最準(zhǔn)確的是采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性，但是有的標(biāo)準(zhǔn)品不易市購，有的價(jià)格較高。由于氣-質(zhì)聯(lián)用儀本身帶有質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，所以采用質(zhì)譜定性最簡單；但由于一些同分異構(gòu)體的質(zhì)譜圖幾乎相同(如二丙基二硫醚和二異丙基二硫醚)，采用質(zhì)譜定性有時(shí)存在一定局限性。采用保留指數(shù)定性相對也較簡單，但是有的物質(zhì)的保留指數(shù)不一定有文獻(xiàn)報(bào)道值，且不同儀器測得的值有一定的偏差。采用香氣特征進(jìn)行定性時(shí)，需要有嗅覺檢測器，且嗅聞人員需要經(jīng)過訓(xùn)練，主要用于檢測是否具有香氣的成分。因?yàn)槊糠N定性方法都存在一定的局限性，所以嚴(yán)格來說應(yīng)該至少采用2種定性方法對揮發(fā)性成分進(jìn)行定性。在早期采用氣相色譜儀對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析時(shí)，鑒定出來的成分較少，主要采用標(biāo)準(zhǔn)品定性；1990年我國開始有采用氣-質(zhì)聯(lián)用儀分析醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分的文獻(xiàn)報(bào)道[35]，2007年以后隨著氣-質(zhì)聯(lián)用儀在國內(nèi)的普及，目前國內(nèi)主要采用質(zhì)譜對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性，而采用標(biāo)準(zhǔn)品定性的中文文獻(xiàn)極少；采用保留指數(shù)對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性的文獻(xiàn)報(bào)道較少，近兩年才見文獻(xiàn)報(bào)道[36]。使用氣相色譜-嗅聞儀(GC-O)對醬油中的揮發(fā)性成分的香氣進(jìn)行嗅聞，利用未知組分的香氣特征，可以對其進(jìn)行初步定性，這種方法在國外已經(jīng)使用十多年，而國內(nèi)近年來也開始使用。

目前國內(nèi)對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定量時(shí)所采用的方法有面積歸一化法、內(nèi)標(biāo)半定量法和外標(biāo)法[30]，在這3種方法中，面積歸一化法用得最多，因?yàn)樵摲椒ㄗ詈唵?，但是定量結(jié)果極其不準(zhǔn)；內(nèi)標(biāo)半定量法比面積歸一化法要準(zhǔn)確，但是比外標(biāo)法準(zhǔn)確性要差；國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)標(biāo)法所采用的內(nèi)標(biāo)物有2-辛醇[26]、3-辛醇[37]、2-甲基-3-庚酮[13]、環(huán)己酮[38]、乙酸正戊酯[39]、庚酸甲酯[40]。英文文獻(xiàn)中報(bào)道的定量醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的主要方法是內(nèi)標(biāo)半定量法、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法[27]、標(biāo)準(zhǔn)加入法[29]，3種方法中，最準(zhǔn)確的是標(biāo)準(zhǔn)加入法，但是對實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作要求較嚴(yán)格；英文文獻(xiàn)中所采用的內(nèi)標(biāo)有2-辛醇[22]、2-甲基-3-庚酮[2]、丙烯酸[41]、2-乙基丁酸[2]、2,4,6-三甲基吡啶[2]、2-乙?；拎41]、2-乙基丁酸乙酯[29]、3-甲基戊酸乙酯[41]。

3 目前國內(nèi)研究醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分存在的問題

從醬油中鑒定出來的揮發(fā)性成分已經(jīng)超過300多種[42]，對醬油香氣有貢獻(xiàn)的應(yīng)該是關(guān)鍵香氣成分，而目前國內(nèi)的研究還主要集中在提取與分析揮發(fā)性成分上。為了發(fā)現(xiàn)醬油的關(guān)鍵香氣成分，研究中應(yīng)該采用分子感官科學(xué)的方法，從篩選樣品中的香氣活性成分開始，即采用GC-O分析樣品。

在對醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行提取時(shí)，大多數(shù)都采用了一種提取方法；由于每種提取方法都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，采用一種方法很難將醬油中存在的揮發(fā)性成分全部提取出來，因此應(yīng)該采用2種優(yōu)勢互補(bǔ)的方法來提取。目前國際上比較認(rèn)可的提取方法是SAFE與頂空取樣(或SAFE與SPME)相結(jié)合。

在定性方面，國內(nèi)90%以上都只采用質(zhì)譜一種方法來定性，定性結(jié)果不夠準(zhǔn)確；食用香料香精工業(yè)國際組織(IOFI)的分析方法工作小組就鑒別風(fēng)味物質(zhì)所做的聲明中提到，至少應(yīng)該采用2種方法對風(fēng)味成分進(jìn)行定性[43]，這也是一些SCI收錄期刊所遵循的原則。在定量方面，多數(shù)采用面積歸一化法進(jìn)行定量，只有少數(shù)采用內(nèi)標(biāo)半定量(其中又只有極少數(shù)測定了內(nèi)標(biāo)物與被定量成分的相對校正因子[37,44])，定量結(jié)果參考價(jià)值很低。目前國際上已經(jīng)采用穩(wěn)定同位素對風(fēng)味成分進(jìn)行定量分析，而國內(nèi)只是剛剛起步[45]。

在進(jìn)行GC-O分析時(shí)，經(jīng)常遇到能夠嗅聞到強(qiáng)度很大且FD因子較高的香氣，但是由于它們在檢測器上沒有響應(yīng)，不能給出明顯的色譜峰，它們的作用經(jīng)常被忽略。在研究過程中可采用保留指數(shù)、香氣特征對它們進(jìn)行初步定性，然后采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證；可參照相關(guān)文獻(xiàn)，對它們的含量進(jìn)行估算[46-47]。

4 展望

醬油是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品之一，隨著揮發(fā)性成分提取技術(shù)的不斷發(fā)展和現(xiàn)代科學(xué)分析儀器的普及，越來越多的研究人員開展醬油的揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取、分離與鑒定，研究過程中只要采用分子感官科學(xué)的方法，以風(fēng)味為導(dǎo)向，就能鑒定出醬油中的關(guān)鍵香氣成分，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致不同來源的醬油整體風(fēng)味差別的主要原因，研究結(jié)果可以為企業(yè)的生產(chǎn)工藝改進(jìn)、菌種篩選、品質(zhì)控制提供理論依據(jù)和指導(dǎo)作用。