抗性淀粉及其遺傳改良研究進展

(長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

丁保淼

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

王容，胡倩文，張文英

(長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

淀粉作為食物中的主要成分，按照其在人體小腸中被消化吸收的快慢分為快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉(Resistant Starch，RS)[1]。RS是α 1, 4 D-葡聚糖的線性分子，主要來源于退化的直鏈淀粉，不像普通淀粉那樣易被快速消化。一般情況下，淀粉中的RS含量與其直鏈淀粉含量之間有極強的相關性。Granfeldt等[2]在谷類食品的研究中發(fā)現(xiàn)，高直鏈淀粉的谷類食品RS含量為20%，比普通淀粉的谷類食品高17%，高直鏈淀粉的產(chǎn)品具有生產(chǎn)高RS的潛力。Morita等[3]在玉米淀粉的研究中也說明了上述兩者之間有很強的相關性。有研究通過提高直鏈淀粉含量來獲得高RS含量[4,5]。但在豌豆這個作物中，上述兩者的相關性不明顯，直鏈淀粉含量處于中等，而RS含量非常高[6]。

RS因具有降低胰島素反應、緩解糖尿病、控制體重、促進礦物質(zhì)離子的吸收等多種生物學功能而受到廣泛關注，在人體的健康上具有廣闊的應用前景。筆者主要從RS的類型、生理功能、測定方式以及抗性淀粉的遺傳基礎與改良等方面進行綜述，以期為RS的研究與應用提供參考。

1 RS的定義與分類

目前普遍接受的RS定義是“健康者小腸中不被吸收的淀粉及其降解物”[7]。早期RS的分類包括3種類型，即RS1、RS2和RS3，近些年又將RS4和RS5這2種類型列入其中[1,8,9]。

RS1為物理包埋淀粉?？赡苁怯捎诠攘?、種子或者塊兒莖中存在完整的細胞壁，但由于腸道中缺乏細胞壁降解酶，導致其不能降解細胞壁成分，從而產(chǎn)生了物理屏蔽作用，或者是因為蛋白質(zhì)的存在使淀粉酶不能與其接觸，從而不能產(chǎn)生消化作用。

RS2為天然淀粉顆粒，通常存在于薯類和生香蕉中，因其結構緊湊，淀粉酶和消化酶不易與其接觸[10]，RS2對淀粉酶具有強的抗性。具有高直鏈淀粉的玉米淀粉就是一種RS2，即使在食品加工和制備過程中仍然保持著其結構和抗性。RS2又分為3種結晶類型(A、B、C)，其中B型結晶的抗性更強[11]。RS1和RS2經(jīng)過一些加工處理可以再次被淀粉酶消化[12]。

RS3稱為回生淀粉，是退化或重結晶的直鏈淀粉，主要在糊化淀粉的冷卻過程中形成，也可在保持低溫或室溫的熟食中形成。淀粉糊在低溫下儲存一段時間，可獲得具有高度熱穩(wěn)定性的由直鏈淀粉雙螺旋聚集而形成的B型晶體結構，而在沸騰溫度下儲存則表現(xiàn)為A型結晶[13]。直鏈淀粉形成的結晶稱為RS3b，比支鏈淀粉形成的部分結晶具有更高的抗酶解性，而支鏈淀粉的結晶過程緩慢，經(jīng)55～70℃的溫度加熱處理后，可被淀粉酶降解，稱為RS3a[14,15]。RS3作為抗性淀粉的重要組成部分，受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關注[13]。

RS4稱為化學修飾淀粉，主要是一些化學修飾及官能團的取代改變了淀粉分子的組成和結構，從而對淀粉分解酶具有抗性，例如磷酸化淀粉、羥丙基二淀粉、乙?；矸垡约皫追N官能團的共同作用等。并有研究表明，被取代淀粉的抗性隨著取代度的增加而增加[16]。

RS5是直鏈淀粉-脂質(zhì)復合物，它是由直鏈淀粉內(nèi)部的非極性區(qū)和脂質(zhì)之間的疏水性區(qū)域的相互作用而形成的一種單螺旋包接結構[9]，其主要是通過促進短鏈脂肪酸的形成，從而對α-淀粉酶產(chǎn)生抗性。

2 RS的生理功能

2.1 控制血糖，防治糖尿病

血糖生成指數(shù)(Glycemic Index,GI)反映了食物最初消化和葡萄糖吸收的應答關系，即可以反映食物對餐后血糖的影響大小。RS的GI值比正常淀粉低，能有效降低人體餐后的血糖水平[17]，有研究發(fā)現(xiàn)長期攝入含有RS的食物不僅能夠降低糖尿病患者血糖水平，也能使健康人群的餐后血糖水平有所改觀[18,19]。

2.2 對腸道的調(diào)節(jié)作用

RS對腸道的調(diào)節(jié)作用主要是通過在結腸中細菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)。其中丁酸作為結腸膜細胞的主要能量來源，會被結腸膜細胞優(yōu)先轉運[20]，可使腸道細胞的代謝和轉化得到抑制，從而降低結腸癌的發(fā)病風險[21]。此外，SCFA能夠通過降低腸道pH而對腸道起到凈化作用[22]。另外，RS作為一種益生元，選擇性地刺激結腸中的一種或是幾種益生菌物種的生長或活性，從而改善宿主健康[15]。

2.3 防止脂肪堆積，有利于控制體重

許多研究已經(jīng)表明，RS能降低各種脂蛋白及總脂質(zhì)和膽固醇的含量，通過給大鼠喂食含有25% RS含量的生馬鈴薯，顯著提高了盲腸大小以及短鏈脂肪酸(SCFA)在結腸中的吸收[23,24]。此外，在大鼠中觀察到所有脂蛋白組分中膽固醇濃度的降低，高密度脂蛋白和甘油三酯的濃度降低尤為明顯[25]。Lopez等[24]研究指出用RS代替膳食中總碳水化合物的5.4%，能使餐后脂類的氧化水平顯著提高。Aziz等[26]通過高RS含量食品喂食肥胖大鼠試驗，發(fā)現(xiàn)可顯著降低其體重，證明了RS具有控制體重的作用。

2.4 促進礦物質(zhì)的吸收

RS可以提高人體和大鼠中對一些礦物質(zhì)的回腸吸收。研究表明，RS可提高人類對鈣的吸收率，以及RS可提高大鼠對鈣、鎂、鋅和銅等礦物質(zhì)的吸收效率[27]。RS促進無機鹽吸收的原因可能是SCFA使盲腸壁變得肥大，增大了無機鹽吸收的表面積，從而使各種無機離子的吸收能力增強[28]。

3 RS的測定

目前，AOAC 2002.02作為RS測定的國際標準在全球的谷類作物中通用。這是體外測定方法中的一種，其基本原理是根據(jù)RS的抗酶解性去除可消化淀粉，再根據(jù)RS溶于氫氧化鉀或者是二甲亞砜溶液能被淀粉酶溶解，從而間接測定抗性淀粉含量，因其結果可靠、實驗重復性好而被廣泛接受，是目前測定RS含量最常用的一種方法。但該方法繁瑣、耗時、成本高，越來越多的研究者開始研究簡單、快速、準確的抗性淀粉測定方法。

近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)分析技術是一項簡單、準確且高效的物理檢測技術，根據(jù)被檢測樣品中某一化學成分對近紅外區(qū)光譜的吸收特性進行定量測定[29]。通過多種分析技術的綜合應用，例如被測物質(zhì)的濃度或是其他各種性質(zhì)的分析技術、近紅外分析技術和化學計量學光譜軟件技術，建立各種組分含量和近紅外光譜有關的定標模型，從而通過被測樣品的近紅外光譜就可快速預測出相關數(shù)據(jù)。在RS含量測定的應用上，已在甘薯[30]、馬鈴薯[31]、水稻[32]中有所報道。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIRS)分析技術被廣泛應用于單糖(葡萄糖、果糖)、多糖[33](麥芽糖、蔗糖、果聚糖)、蛋白質(zhì)、脂肪[34]等成分的含量測定。FTIRS在400～4000cm-1的光譜范圍內(nèi)，峰型較尖銳，對化學鍵的振蕩頻率敏感。通過實驗數(shù)據(jù)將FTIR上的譜帶吸光度與不同化學鍵的振動模式進行匹配，峰強度的變化可表明由于鏈長度和結晶度改變而引起的淀粉結構構象變化，而吸收帶幅度的變化可以用來精確地表示RS形成過程中內(nèi)部和分子間氫鍵的組合[15]。與天然淀粉相比,分析各種來源RS的FTIR光譜發(fā)現(xiàn)，其化學基團沒有發(fā)生變化，但某些譜帶的吸收強度和振動幅度卻有所不同。例如通常使用1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1處的吸收帶積分面積的比率來量化RS的結晶度和分子順序，1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1比率越高，表明淀粉顆粒中結晶區(qū)域所占比例越高[35～37]。蓮子籽RS在995cm-1/1022cm-1的光密度比率(1.00)比天然淀粉(0.87)高，表明微晶的存在是由有序的淀粉鏈形成的。此外， RS在800～1200cm-1范圍內(nèi)的吸收強度(C—C、C—OH和C—H伸縮振動)均比原生淀粉弱，說明蓮子RS發(fā)生了構象變化[37,38]。高直鏈淀粉的RS比消化前的淀粉具有更高的1047cm-1/1022cm-1比率[36]。從退化的玉米餅中分離的RS中的—OH帶(～2930cm-1)比天然淀粉更明顯，且在RS中發(fā)現(xiàn)羧基帶(1743cm-1)與玉米淀粉的對照譜相比更顯著[39]。以上結果說明了FTIRS技術不僅可以通過化學基團及其特征對待測物質(zhì)進行定性分析，也可以和NIRS技術一樣通過建立相關模型從而對待測物質(zhì)進行定量分析。

配有折射率檢測器的高效凝膠排阻色譜(High performance size exclusion chromatography，HPSEC)可用于RS分子量的測定。淀粉的重量平均分子量(Mw)和數(shù)量平均分子量(Mn)比值表示多分散指數(shù)(Mw/Mn)，多分散指數(shù)的值越大，分子量分布越寬[37]。通過使用SEC結合多角度光散射和折射率檢測器，經(jīng)過壓熱法、微波法和超聲波輔助壓熱法制備的純化蓮子RS的分子量分布在小于2×104g/mol的范圍內(nèi)，所占的比例為86.6%～89.9%，而分子量范圍在(2～3)×104g/mol和大于3×104g/mol的范圍內(nèi)所占的比例分別為5.6%～7.3%和7.0%，通過這些處理制備的RS的Mw/Mn在1.247和1.298之間，表明RS樣品具有相對窄的分子量分布[38]。聚合度(Degree of Polymerization，DP)表示每個聚合物鏈的葡萄糖單元數(shù)。分子量或DP的數(shù)據(jù)可以通過在HPSEC中的具有不同摩爾質(zhì)量范圍的累積重量分數(shù)的多組分DP的組合峰而獲得。

4 RS的遺傳基礎

4.1 RS的形成過程及影響因素

RS主要是由大量直鏈淀粉和少量極限糊精回生聚合而成，淀粉糊化后，其晶體結構發(fā)生改變，打亂后的淀粉分子在冷卻過程中再重新聚合、卷曲、折疊，形成新的晶體。

已有報道指出高直鏈淀粉對RS的生成有積極作用[4,5]，熱濕處理的蠟質(zhì)馬鈴薯抗性淀粉(HMT-RS)中分離出的RS與HMT馬鈴薯淀粉和HMT-RSC(快速消化淀粉)+SDS(緩慢消化淀粉)相比，具有較高比例的長鏈(聚合度DP≥37)和較低比例的短支鏈(聚合度DP為6～12)，在淀粉回生過程中支鏈淀粉分子中大量短鏈中斷了具有酶抗性的微晶形成，而具有少量短鏈和大量長鏈的支鏈淀粉分子優(yōu)先形成相對完美的抗消化微晶[40,41]。相對合適的DP有益于形成雙螺旋和結晶[42]。鏈長為30～40個葡萄糖殘基似乎是形成RS的必要條件。另外有研究表明，少量脂類的存在對RS的形成也具有積極影響，即可提高RS的產(chǎn)率[43]。

4.2 淀粉形成的生物學基礎

淀粉合成關鍵酶的種類、功能及在許多作物上的研究進展已被許多研究者所報道[44]。淀粉合成關鍵酶對RS的形成及含量的影響成為研究熱點。目前以下幾種酶被發(fā)現(xiàn)對RS的形成具有一定影響。

4.2.1 可溶性淀粉合成酶(SSS)

SSS具有SSSⅠ、SSSⅡ和SSSⅢ 3種同工酶類型。研究表明這3種同工酶分別負責短鏈、中等長度和長鏈淀粉的合成[45]。玉米、小麥、水稻等作物的SSS同工酶基因已經(jīng)基本被定位，如Jiang等[46]將水稻中編碼的SSS的基因定位在第10、2和6號染色體上。Zhou等[47]采用基于圖譜的克隆方法，首先將鑒定出的和RS形成有關的突變體b10基因定位于8號染色體上，然后對412株植物進行大規(guī)模連鎖分析，又將基因定位在M6和M8標記之間的456kb區(qū)域，通過Gramene數(shù)據(jù)庫的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個有缺陷的可溶性淀粉合成酶基因(SSⅢa)，負責RS的產(chǎn)生，且純合突變體ssⅢassⅢa植物具有5.8%的RS含量，是野生型R7954植物(SSⅢaSSⅢa)的3倍，接下來又證明RS的產(chǎn)生依賴于顆粒結合淀粉合成酶Waxya(Wxa)等位基因的高表達，它們共同調(diào)節(jié)水稻中的RS生物合成，且發(fā)現(xiàn)純合ssⅢa突變體與純合秈稻W(wǎng)xaWxa等位基因組合產(chǎn)生更高RS含量(6.1%)，這一發(fā)現(xiàn)為提高米飯中尤其是在亞洲南部占主導地位的秈米中RS含量，帶來了可喜的前景。

4.2.2 淀粉分支酶(SBE)

不同的植物類型對SBE命名不同，小麥、水稻、玉米等谷類作物中常用SBEⅠ和SBEⅡ(SBEⅡa和SBEⅡb)命名，在豌豆和馬鈴薯等中常以B(SBEⅠ)和A( SBEⅡ)來命名[48]。玉米同工酶SBE Ⅰ和SBE Ⅱ分別負責中等、長鏈和短鏈葡聚糖的合成[49]。大麥中SBEⅡa和SBEⅡb的編碼基因和小麥中SBE Ⅰ的主效基因分別被定位于第2、5號和7D染色體的短臂末端[50,51]。Carciofi等[52]通過協(xié)同沉默所有SBE基因發(fā)現(xiàn)大麥籽粒胚乳內(nèi)只產(chǎn)生直鏈淀粉，且在僅含直鏈淀粉的天然淀粉、凝膠化淀粉和退化的淀粉中RS含量分別為90%、65%和68%，遠超過煮熟的香蕉和馬鈴薯中的RS含量(30%)。Hazard等[53]通過SBEⅡa-A敲除突變和SBEⅡa-B剪接位點突變的小麥雙突變體使直鏈淀粉含量增加22%(P<0.0001)，抗性淀粉含量增加115%(P<0.0001)。

4.2.3 淀粉脫支酶(DBE)

DBE主要用于調(diào)節(jié)分支以及維護支鏈淀粉的結晶度[54]。DBE根據(jù)催化底物的不同可分為異淀粉酶(ISA)和極限糊精酶(ZPU)，后者在淀粉合成過程中起著某種程度的補償作用[55,56]。編碼這2種酶的基因都是單拷貝基因，在玉米、水稻、小麥等植物中發(fā)現(xiàn)編碼ISA的基因位于su1位點[57,58]。另外，異淀粉酶被認為對抗性淀粉的形成有一定的影響，一種來自珊瑚菌菌株EGB的新型脫支酶Iso M，是一種典型的異淀粉酶，研究發(fā)現(xiàn)，RS含量可以隨著Iso M處理的分支時間的增加而增加，并且在I U Iso M處理24h時達到最大值(70.9%)，這與來自支鏈淀粉酶(Promozyme?D2)處理的73.9%RS含量相當，有效的脫支活動使Iso M成為生產(chǎn)RS的候選者，同時，基于異淀粉酶和α-淀粉酶在淀粉中形成麥芽低聚糖的特點， Iso M可以在淀粉加工中與其他淀粉分解酶結合使用[59]。

5 RS的遺傳改良

近10年來，國內(nèi)外育種者通過輻射誘變、化學誘變等方法來創(chuàng)造具有高RS含量的改良新品種，并取得了初步成效。

Zhou等[47]為了找到RS的新基因，通過篩選γ-輻射的雜交稻恢復系R7954，鑒定了1種突變體b10， 在熟米中有高的RS含量。Bai等[60]通過CRISPR/Cas9技術對水稻中SBE3基因編輯，發(fā)現(xiàn)了2個純合突變體，其RS含量高達10%。化學誘變的使用得到了1個RS含量較高的裸大麥品種Himalaya 292[61]。Carciofi等[52]通過沉默所有SBE基因，發(fā)現(xiàn)大麥籽粒胚乳內(nèi)只產(chǎn)生直鏈淀粉，且僅含直鏈淀粉的天然淀粉中有高含量的RS(90%)。張志轉[62]通過對蘇麥6號干種子誘變，在M3代中篩選鑒定了1個RS含量較高且表達穩(wěn)定的突變株系，在M4代中分析發(fā)現(xiàn)其RS含量比蘇麥6號高7倍，定名突變體WRS-1。張貞彩[63]通過使用EMS誘變技術進行RS材料的篩選，其中含量最高的材料為M08412-5。高直鏈淀粉玉米GEMS-0067品系是由譜系GUAT209：S13×(H99ae×OH43ae)的F5衍生系內(nèi)的同胞交配獲得的[64]，其是隱性直鏈淀粉擴充基因(ae)和未知的高直鏈淀粉修飾基因(HAM)的純合突變體，它產(chǎn)生的RS含量比玉米ae單突變體高約25%[65]。Lee等[66]的研究表明適當劑量的輻射可以顯著增加玉米淀粉中的RS含量。

6 展望

攝入RS含量越高，越有助于提高人們的健康水平，然而普通熱米飯中RS含量少于3%[25,67]?；赗S的諸多益處，若增加谷物中RS的含量，不僅能為糖尿病患者提供高質(zhì)量的食物，也有助于提高人群的健康水平。在當今時代中，人們比以往任何時候都更容易出現(xiàn)與生活方式有關的疾病，增加RS的攝入量是對抗這些疾病的健康方式[68]。但目前RS含量較高的作物新品種還不夠豐富，遺傳機理的研究也不夠深入，還需要在RS遺傳改良的路上走的更遠?；蚪M編輯技術的應用，與常規(guī)育種、化學或物理輻射誘變以及轉基因技術相比，可以以簡便的方式更精確地修飾靶基因，產(chǎn)生定向誘變[69]，而且不需要復雜的回交和雜交，節(jié)約了大量的時間，在作物改良中具有相對的優(yōu)勢。Sun等[70]使用CRISPR / Cas9介導的基因組編輯技術在水稻的SBEⅠ和SBEⅡb中產(chǎn)生定向誘變，并成功地獲得了直鏈淀粉含量(25.0%)和RS含量(9.8%)顯著增加的無轉基因的純合sbeⅡb突變體，這可能對其他谷類作物的RS生物合成具有一定的參考意義。另外可以結合突變體庫的創(chuàng)制，利用分子輔助標記育種等快速準確的技術加快新產(chǎn)品的快速利用。