核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)黃曲霉毒素B1

班 珺 謝巖黎

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1，鄭州 450052)(河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鄭州 450052)(廣西崇左市食品藥品監(jiān)督管理局;崇左市食品藥品檢驗(yàn)所3，崇左 532200)

黃曲霉毒素是由黃曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等產(chǎn)生的一類含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物[1-2]。在已分離出的20余種黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)致癌性最強(qiáng)，被認(rèn)為是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要因素之一[3]。為保障食品安全及人類健康，GB 2761—2017[4]對(duì)我國(guó)食品中AFB1的限量規(guī)定為：花生、玉米及其制品≤ 20 μg/kg，稻谷、糙米、大米、植物油脂≤ 10 μg/kg，谷物類、豆類、堅(jiān)果類、釀造調(diào)味品≤ 5 μg/kg。長(zhǎng)期以來(lái)，科研工作者為AFB1的檢測(cè)探索了許多方法，常見的傳統(tǒng)方法有薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]等，新興的檢測(cè)方法有電化學(xué)免疫傳感器[9]、化學(xué)發(fā)光免疫法[10]、太赫茲光譜法[11]、核酸適體法[12]等，這些方法的產(chǎn)生極大豐富了AFB1的檢測(cè)。當(dāng)前針對(duì)AFB1的檢測(cè)方法眾多，每種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，儀器檢測(cè)法靈敏度高、結(jié)果較為可靠，但所需儀器昂貴、前處理復(fù)雜繁瑣，不便于大批量檢測(cè)；免疫學(xué)法檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單，但所用的抗體制備成本高，保存條件苛刻，批間質(zhì)量不一，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，開發(fā)高效、便捷、靈敏的檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。

核酸適體(Nucleic acid aptamer)是采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從體外人工合成的單鏈核酸文庫(kù)中篩選出能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸片段[13-14]。核酸適體因其靶物質(zhì)范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在毒素[15-18]、蛋白[19-22]、激素[23-25]、農(nóng)藥[26-28]、金屬離子[29-31]、細(xì)胞[32-35]等的檢測(cè)領(lǐng)域成為重要工具。目前，基于核酸適體的AFB1檢測(cè)方法，如納米金法[36]、化學(xué)發(fā)光法[37]、電化學(xué)法[38]等相繼報(bào)道。

本研究根據(jù)核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號(hào)檢測(cè)靶分子的原理[39-40]，將標(biāo)記有羧基熒光素(Carboxy Fluorescein,FAM)的AFB1核酸適體與標(biāo)記猝滅基團(tuán)(Black Hole Quencher 1,BHQ1)的AFB1核酸適體互補(bǔ)鏈配對(duì)雜交，通過(guò)AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸適體的位點(diǎn)使熒光恢復(fù)，建立了基于核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)AFB1的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Cary Eclopse熒光分光光度計(jì)：美國(guó)VARIAN公司，實(shí)驗(yàn)測(cè)定參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)505～600 nm，激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma Aldrich公司；玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品：北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、HCl、三羥甲基氨基甲烷等：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用AFB1核酸適體及其互補(bǔ)鏈均由上海生工生物工程有限公司合成并經(jīng)HPLC純化，序列如下：核酸適體1：5′-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；猝滅鏈1：5′ -ACACGTGCCCAAC-BHQ1-3′； 核酸適體2：5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGG CCCACA-FAM-3′； 猝滅鏈2：5′-BHQ1-TGTGGGCCTAGCG-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光基團(tuán)標(biāo)記位置及工作液的選擇

以PBS為工作液，比較FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記核酸適體不同端位對(duì)熒光恢復(fù)情況的影響，選擇熒光恢復(fù)率最佳的核酸適體鏈，以Tris-HCl為工作液測(cè)定檢測(cè)系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率，比較不同工作液對(duì)熒光恢復(fù)情況的影響。通過(guò)(F-F0)/F0求熒光增長(zhǎng)率，其中F0為猝滅狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強(qiáng)度。

1.2.2 猝滅鏈濃度的選擇

用工作液將BHQ1標(biāo)記的猝滅鏈配制成100、120、140、160、180、200、220、240 nmol/L，分別與200 nmol/L FAM標(biāo)記核酸適體反應(yīng)30 min并測(cè)定其熒光強(qiáng)度，觀察不同濃度互補(bǔ)鏈對(duì)核酸適體熒光基團(tuán)的猝滅程度。

1.2.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

將200 nmol/L核酸適體與猝滅鏈反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)體系加入50 ng/mL AFB1并記錄其加入反應(yīng)體系10、20、40、60、80、120 min后的熒光強(qiáng)度，選擇最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4 AFB1的定量檢測(cè)

用PBS緩沖液將核酸適體2、猝滅鏈2配制成200 nmol/L，將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/mL，在優(yōu)化好的檢測(cè)體系中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。400 μL 200 nmol/L核酸適體2與400 μL 200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min后，將800 μL一系列不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液加入反應(yīng)體系，充分反應(yīng)1h后測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以AFB1濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立熒光法檢測(cè)AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 方法特異性考察

將赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)配制成100 ng/mL。以PBS作為工作液，將200 nmol/L核酸適體2與200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min，分別向反應(yīng)體系中加入100ng/mL OTA、ZEN、DON，平衡孵育1h后采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。通過(guò)(F-F0)/F0對(duì)該檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行分析，其中F0為猝滅狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 樣品測(cè)定

將花生、玉米粉碎，過(guò)20目篩，稱取5 g樣品，以20 mL乙腈-水(85∶15)為提取液高速均質(zhì)5 min，4 000 r/min高速離心5 min后取4 mL上清液，氮吹儀吹干提取液，加入1mL PBS工作液復(fù)溶，采用優(yōu)化好的檢測(cè)方法測(cè)定樣品的初始濃度C0?；厥諏?shí)驗(yàn)中，向樣品加入不同量的AFB1，使樣品含AFB1分別為5、20、60 μg/kg，采用優(yōu)化好的檢測(cè)方法檢測(cè)加標(biāo)后的檢測(cè)濃度C1，以(C1-C0)/加標(biāo)濃度計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

檢測(cè)原理如圖1所示，AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸適體的位點(diǎn)，導(dǎo)致猝滅基團(tuán)標(biāo)記的核酸互補(bǔ)鏈脫落，核酸適體構(gòu)象發(fā)生改變，檢測(cè)體系熒光恢復(fù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化對(duì)AFB1進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)初始狀態(tài)為標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM)的AFB1核酸適體與標(biāo)記猝滅基團(tuán)(BHQ1)的互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，由于二者之間距離很近，導(dǎo)致FAM被BHQ1猝滅，檢測(cè)體系處于弱熒光的猝滅狀態(tài)。當(dāng)待測(cè)物中含AFB1，AFB1將與核酸適體發(fā)生特異性結(jié)合，核酸適體結(jié)構(gòu)的改變迫使互補(bǔ)鏈從核酸適體上脫落，使熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)的距離變遠(yuǎn)，檢測(cè)體系中熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)。當(dāng)待測(cè)物中無(wú)AFB1存在時(shí)，核酸適體結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，熒光強(qiáng)度維持初始的猝滅狀態(tài)。

圖1 AFB1檢測(cè)原理示意圖

2.2 熒光基團(tuán)標(biāo)記位置及工作液的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記核酸適體端位及反應(yīng)體系的工作液進(jìn)行了研究。核酸適體1為5′端標(biāo)記FAM的寡核苷酸序列，核酸適體2為3′端標(biāo)記FAM的寡核苷酸序列。圖2為等濃度核酸適體1、核酸適體2于不同工作液中的熒光強(qiáng)度比較，圖3為核酸適體1、核酸適體2在猝滅狀態(tài)加入AFB1后的熒光增長(zhǎng)率。由圖2、圖3比較可知，工作液為PBS時(shí)，等濃度的核酸適體2熒光強(qiáng)度高于核酸適體1，造成該結(jié)果的原因可能為核酸適體5′ 末端的鳥嘌呤對(duì)FAM熒光基團(tuán)產(chǎn)生了一定的猝滅作用，熒光強(qiáng)度較標(biāo)記在3′端序列的熒光強(qiáng)度弱。當(dāng)加入猝滅鏈?zhǔn)笷AM猝滅80% 后加入50 ng/mL AFB1，核酸適體2的熒光增長(zhǎng)率(60.08%)明顯高于核酸適體1的熒光增長(zhǎng)率(17.82%)，該結(jié)果表明FAM標(biāo)記在3' 端的核酸適體較標(biāo)記在5' 端的核酸適體更有利于與AFB1結(jié)合，這與核酸適體自身形成的空間位阻及AFB1有效識(shí)別區(qū)域有關(guān)。

以核酸適體2進(jìn)一步研究工作液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，由圖2可知，等濃度核酸適體下，以PBS為工作液的熒光強(qiáng)度略高于以Tris-HCl為工作液的熒光強(qiáng)度，當(dāng)加入猝滅鏈?zhǔn)笷AM均猝滅80% 后加入50 ng/mL AFB1，以PBS為工作液的核酸適體熒光增長(zhǎng)率(60.08%)高于以Tris-HCl為工作液的熒光增長(zhǎng)率(30.58%)(圖3)。上述結(jié)果表明以PBS為工作液更有利于FAM的熒光發(fā)生，也更有利于AFB1與核酸適體的結(jié)合。綜合考慮，選擇核酸適體2并以PBS為工作液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

圖2 200 nmol/L核酸適體1與核酸適體2于不同工作液中的熒光比較

圖3 猝滅狀態(tài)下加入50 ng/mL AFB1后的熒光增長(zhǎng)率

2.3 猝滅鏈濃度的選擇

向200 nmol/L核酸適體2中加入一系列濃度(0、100、120、140、160、180、200、220、240 nmol/L)猝滅鏈2，充分反應(yīng)30 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度如圖4所示。猝滅鏈在100 nmol/L至200 nmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度迅速降低，當(dāng)猝滅鏈濃度為200 nmol/L時(shí)，反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度已被猝滅80%，繼續(xù)加大猝滅鏈濃度，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度仍呈減弱狀態(tài)，但變化趨勢(shì)向緩。為防止猝滅鏈濃度過(guò)大對(duì)AFB1競(jìng)爭(zhēng)核酸適體的結(jié)合位點(diǎn)造成影響，實(shí)驗(yàn)最終選擇200 nmol/L作為猝滅鏈最適濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 猝滅鏈濃度的優(yōu)化

2.4 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

200 nmol/L核酸適體2與200 nmol/L猝滅鏈2反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)體系加入50 ng/mL AFB1，圖5為AFB1加入反應(yīng)體系后的10、20、40、60、80、120 min后的熒光強(qiáng)度。由圖看出，在AFB1加入后的10至60 min，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，說(shuō)明隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，AFB1與核酸適體結(jié)合越充分，F(xiàn)AM與BHQ1之間的距離變得越遠(yuǎn)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。AFB1加入60 min后，熒光強(qiáng)度較60 min時(shí)略微增強(qiáng)但程度趨緩，從檢測(cè)效率的角度考慮，最終選擇60 min為AFB1與核酸適體最適反應(yīng)時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

2.5 AFB1的定量檢測(cè)

在優(yōu)化好的檢測(cè)體系中對(duì)一系列濃度AFB1進(jìn)行檢測(cè)，圖6為0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/mL AFB1加入反應(yīng)體系后的熒光光譜圖。由圖7可知，隨著AFB1濃度的增加，F(xiàn)AM與BHQ1距離變遠(yuǎn)，反應(yīng)體系由猝滅狀態(tài)開始恢復(fù)熒光，AFB1濃度越大，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。結(jié)果表明，AFB1在1～300 ng/mL濃度范圍內(nèi)與反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.759 9X+148.928 3(R2=0.996 0)，以空白樣品均值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算得到該檢測(cè)方法的理論檢出限為0.8 ng/mL。

圖6 不同濃度AFB1加入反應(yīng)體系后的熒光光譜圖

圖7 不同濃度的AFB1檢測(cè)

2.6 特異性

為考察本方法的特異性，選擇糧食中常見的幾種毒素：赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，將它們配制成100 ng/mL并運(yùn)用本研究建立的AFB1檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，在反應(yīng)系統(tǒng)中分別加入100ng/mL DON、OTA、ZEN后，熒光增長(zhǎng)率分別為0.20%、3.29%、12.68%，與反應(yīng)猝滅狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度接近，而AFB1在100 ng/mL時(shí)的熒光增長(zhǎng)率為90.44%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他毒素，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所選用的核酸適體對(duì)AFB1具有極強(qiáng)的識(shí)別選擇性，本研究建立的AFB1檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)。

圖8 方法選擇性考察

2.7 回收率

以花生、玉米為樣本向其中添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使?jié)舛确謩e為5、20、60 μg/kg，采用本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，花生中的AFB1回收率為95.4%～108.0%之間，玉米中的AFB1回收率為77.7%～84.7%之間，效果良好。

表1 實(shí)際樣品的測(cè)定

3 結(jié)論

利用核酸適體能對(duì)靶物質(zhì)特異性結(jié)合迫使互補(bǔ)鏈解離的作用，建立了核酸適體識(shí)別AFB1熒光恢復(fù)檢測(cè)法。該法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好，可以滿足實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)需求。該檢測(cè)方法的原理同樣適用于對(duì)其他基于核酸適體檢測(cè)小分子靶物質(zhì)的方法設(shè)計(jì)。