以金屬有機(jī)框架材料為基質(zhì)免疫磁珠的制備及在玉米樣品檢測(cè)中應(yīng)用

孫毅蒙 丁 軻 韓 濤 陳湘寧

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院1，北京 102206 )(食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室2，北京 102206)(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，北京 102206)

金屬-有機(jī)框架(Metal-Organic Frameworks)，簡(jiǎn)稱MOFs，是由有機(jī)配體和金屬離子或團(tuán)簇通過(guò)配位鍵自組裝形成的具有分子內(nèi)孔隙的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化材料[1-3]。該類材料將無(wú)機(jī)金屬節(jié)點(diǎn)與有機(jī)框架通過(guò)配位鍵結(jié)合在一起，形成了多種多樣的結(jié)構(gòu)，并由此導(dǎo)致其具有豐富的性質(zhì)，從而在諸多領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景[3-4]。應(yīng)用于樣品前處理的金屬有機(jī)框架材料主要有IRMOF類、MIL類、UiO類、ZIF類和金屬有機(jī)框架復(fù)合材料等，它們都具有多孔的結(jié)構(gòu)，對(duì)目標(biāo)物有良好吸附性，多被用來(lái)作為固相萃取的填料[5-7]。Liang等[8-9]通過(guò)對(duì)小分子配體核苷酸和金屬離子間的反應(yīng)研究，合成了超分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)金屬-有機(jī)凝膠。它是由AMP和Zn2+通過(guò)配位鍵自組裝的方式形成的，具有多孔結(jié)構(gòu)，性能穩(wěn)定，可以固定抗體。該材料在制備及偶聯(lián)抗體的過(guò)程中，無(wú)需特殊反應(yīng)條件和試劑，制備簡(jiǎn)單[5]。我們將其作為一種免疫基材與當(dāng)前熱門的研究-納米磁珠技術(shù)[10-11]結(jié)合起來(lái)，制備出了一種新型的以AMP&ZnCl2水凝膠為基質(zhì)的免疫磁珠[13-15]。

真菌毒素種類繁多，毒性大，有致癌、致畸、致突變作用，嚴(yán)重威脅人類的健康[16-18]。真菌毒素樣品前處理方法主要有固相(微) 萃取、液相(微) 萃取、免疫親和層析、磁分離技術(shù)等，這些前處理方式雖然都能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分離，但是相應(yīng)的還有一定的缺點(diǎn)。如固相萃取法一般采用固相萃取柱進(jìn)樣填料裝柱麻煩，選擇性也差；液相萃取的缺點(diǎn)是穩(wěn)定性差，不能重復(fù)使用；免疫親和層析法雖然選擇性強(qiáng)，但是成本高、機(jī)械強(qiáng)度差；磁分離技術(shù)的選擇性差，需要用免疫材料輔助來(lái)提高其靈敏度[19]。

本研究就是基于磁分離技術(shù)操作簡(jiǎn)單、機(jī)械強(qiáng)度大、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[20]，選擇了一種制備起來(lái)較為簡(jiǎn)單的免疫基材-AMP&ZnCl2·ZEA單抗，制備成免疫磁珠應(yīng)用到糧谷制品中玉米赤霉烯酮毒素的前處理[21-22]。這種新型的以金屬有機(jī)框架材料為基質(zhì)的免疫磁珠的制備為今后免疫磁珠的深入研究拓寬了思路，其在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用擬為解決食品中真菌毒素的純化問(wèn)題提供方法借鑒，也為新型的真菌毒素檢測(cè)材料的研究和開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ZEA單抗:北京點(diǎn)石科創(chuàng)科技有限公司和本課題組合作研發(fā)制備；甲醇、乙腈(色譜純):美國(guó)Fisher公司；七水合硫酸亞鐵、氫氧化鉀、硝酸鉀、體積分?jǐn)?shù)為25% 戊二醛溶液、司班80、石蠟溶液、氯化鋅(分析純):汕頭市西隴化工廠有限公司；一磷酸腺苷二鈉鹽(色譜純):SIGMA公司；10 mmol/L pH 7.4 HEPES溶液:北京欣華綠源科技有限公司；0.01 mol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液:HyClone公司；玉米粉:回龍觀城北市場(chǎng)；DZTMS-PREP免疫親和柱:德國(guó) R-Biopharm。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜-6410三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)安捷倫公司；DSHZ-300A 水浴恒溫振蕩器:蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀:美國(guó)賽默飛世尓科技分子光譜；S-4300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:日本日立/Hitachi高新技術(shù)公司；HL-2恒流泵:上海滬西分析儀器廠有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器:常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的制備1.3.1.1 Fe3O4磁核的制備[10]

稱取20.0 g七水合硫酸亞鐵溶解于140.0 mL去離子水中，水浴加熱到90 ℃并在轉(zhuǎn)速400 r/min的機(jī)械攪拌條件下反應(yīng)1 h。同時(shí)另取1.6 g硝酸鉀和11.2 g氫氧化鉀溶解于60.0 mL去離子水中，配制好的溶液用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入至亞鐵離子溶液中。添加完畢繼續(xù)在90 ℃下攪拌2 h，得黑色渾濁溶液，用去離子水洗滌數(shù)次并烘干，黑色固體即為四氧化三鐵。

1.3.1.2 AMP&ZnCl2水凝膠包覆磁珠[13]

稱取0.196 g 一磷酸腺苷二鈉鹽溶解于20 mL HEPES buffer(10 mmol/L，pH7.4)中，再加入200 mg 四氧化三鐵，充分?jǐn)嚢琛?50 mL含7%司班80的石蠟混合液在攪拌狀態(tài)下逐滴加入其中，經(jīng)500r/min攪拌形成乳化體系，持續(xù)攪拌30 min水浴加熱至40 ℃，然后加3 mL戊二醛溶液(C5H8O2，體積分?jǐn)?shù)25%)，恒溫交聯(lián)反應(yīng)30 min。降低溫度，在常溫條件下將2 mL 1 mg/mL ZEA單抗用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入反應(yīng)體系中，攪拌均勻后再用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入10 mL 50 mmol/L的ZnCl2溶液，常溫交聯(lián)反應(yīng)2 h。

反應(yīng)結(jié)束后，依次用石油醚、乙醇、去離子水洗滌數(shù)次，用磁鐵分離出固體物即獲得包覆了水凝膠并偶聯(lián)了ZEA單抗的磁性微球，將其封存于HEPES buffer(10 mmol/L，pH 7.4)中。

1.3.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的鑒定與評(píng)價(jià)

1.3.2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的表征

用場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡觀察Fe3O4微球和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠形態(tài)；紅外光譜儀測(cè)定Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠表面官能團(tuán)性質(zhì)：稱取樣品1～2 mg，加入200 mg溴化鉀粉末研磨，壓片法測(cè)定其紅外光譜。

1.3.2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的負(fù)載量及重復(fù)性使用效果

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠于10 mL離心管中，先用超純水洗滌兩遍，用磁鐵收集磁珠除去水洗液。加入3 mL 1.2 μg/mL的ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，在搖床上振蕩反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用磁鐵收集磁珠，取出上清液用孔徑為0.22 μm的有機(jī)相微濾膜過(guò)濾后，測(cè)定其中的ZEA濃度。根據(jù)上清液體積，計(jì)算上清液中ZEA質(zhì)量。用3 mL超純水洗滌兩次磁珠，用磁鐵收集磁珠，合并兩次水洗液用孔徑為0.22 μm的有機(jī)相微濾膜過(guò)濾洗滌液，測(cè)定其中的ZEA濃度，由水洗液體積，計(jì)算水洗液中ZEA質(zhì)量。用3 mL甲醇(3 mL/次)洗滌磁珠三次，每次加入甲醇后振搖10 min，洗脫磁珠上吸附的ZEA毒素，用磁鐵收集磁珠，取出甲醇洗脫液用孔徑為0.22 μm的有機(jī)相微濾膜過(guò)濾后，三次洗脫液不合并，分別測(cè)定甲醇洗脫液中ZEA濃度，根據(jù)每次的醇洗液體積，計(jì)算醇洗液中ZEA總質(zhì)量。

ZEA負(fù)載量=添加的ZEA質(zhì)量-上清液中ZEA質(zhì)量-水洗液中ZEA質(zhì)量

(1)

(2)

1.3.3 ZEA毒素檢測(cè)方法[23]

本實(shí)驗(yàn)使用1200高效液相色譜-6410三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，來(lái)測(cè)定樣品中提取ZEA毒素含量。建立了ZEA液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

色譜條件：Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)，柱溫 45 ℃，進(jìn)樣量 50 μL；流動(dòng)相為10 mM 乙酸銨水溶液 (A)和乙腈 (B)，梯度條件：0～0.1 min，B為10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B為80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。電離模式、監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)和其他參數(shù)見(jiàn)表1

質(zhì)譜條件：離子化模式采用電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；正離子模式(ESI+)噴霧電壓為4500 V；負(fù)離子模式(ESI-)噴霧電壓為2 500 V；離子源溫度 450 ℃；氣簾氣8 L/min。

表1 ZEA毒素的質(zhì)譜參數(shù)

注：※.定量離子。

1.3.4 實(shí)際樣品的應(yīng)用1.3.4.1 實(shí)際樣品中ZEA毒素的提取[21]

稱取玉米粉樣品25.0 g(精確至0.1 g)于500 mL具塞錐形瓶中,加入100 mL70%甲醇溶液(V/V)，浸泡15 min，超聲振蕩40 min，過(guò)濾得到樣品提取液A,取2 mL濾液用48mL PBS溶液稀釋，得到提取液B。

1.3.4.2 免疫親和柱對(duì)實(shí)際樣品的應(yīng)用[21]

取16 mL 提取液B，以2 mL/min的速度過(guò)免疫親和柱，再用16 mL H2O以5 mL/min的速度洗滌柱子；用1 mL 100%甲醇溶液(V/V)以1 d/s的速度洗脫柱子，將洗脫液收集于2 mL的樣液瓶中，再用1 mL H2O以5 mL/min的速度洗滌免疫親和柱，同樣收集于上述樣液瓶中。用Agilent 1200-ESI 6410液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)樣量為50 μL。

1.3.4.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對(duì)實(shí)際樣品的應(yīng)用

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠于50 mL離心管中，先用超純水洗滌兩次，用磁鐵收集磁珠除去水洗液。然后加入30 mL提取液B，振蕩反應(yīng)30 min，用磁鐵收集磁珠去除上清液，加入20 mL超純水以10 mL/次洗滌磁珠兩遍。最后加入30 mL甲醇以10 mL/次洗滌3次，收集三次的醇洗液，用Agilent 1200-ESI 6410液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測(cè)定三次甲醇洗脫液中的ZEA毒素濃度，根據(jù)醇洗液體積，計(jì)算甲醇解吸液中的ZEA總質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的鑒定

2.1.1 SEM表征

用場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。圖1(a、c)所示的是Fe3O4微球的SEM圖片，F(xiàn)e3O4磁核粒徑在100～300 nm 之間，磁核成球不穩(wěn)定，有些磁核呈不規(guī)則狀。由于磁核性質(zhì)較為活潑和外加磁場(chǎng)分離過(guò)程中導(dǎo)致的部分磁珠磁化，使得磁核易發(fā)生團(tuán)聚，分散性不好。圖1(b、d)是Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的SEM圖片，對(duì)比Fe3O4磁核的SEM圖片，可以看出不規(guī)則狀磁核的棱角被鈍化，圖1(b、d)中這些包覆后的磁核都趨于球形，磁核表面也由光滑變得粗糙。通過(guò)對(duì)比分析磁核包覆前后的SEM圖片，可以看出圖1(b、d)中磁核表面有包覆物存在。

圖1 Fe3O4微球(a、c)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠(b、d)SEM表征圖

2.1.2 紅外光譜表征

圖2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的紅外光譜圖

2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的負(fù)載量及重復(fù)性使用的效果評(píng)價(jià)

按照1.3.4.3的方法對(duì)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠重復(fù)使用3次，計(jì)算每次使用的負(fù)載量和回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，發(fā)現(xiàn)每100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的ZEA毒素負(fù)載量為3μg左右，隨著使用次數(shù)的增加，負(fù)載量逐漸下降。這是因?yàn)橐环矫嫦疵搫┘状紩?huì)對(duì)抗體結(jié)構(gòu)造成破壞，使得部分抗體活性降低甚至失活，部分抗原抗體結(jié)合能力減弱或消失；另一方面，由于部分ZEA毒素未能從抗體上洗脫掉，使得抗原抗體的部分結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，導(dǎo)致毒素能夠結(jié)合抗體的位點(diǎn)減少，負(fù)載量下降。

通過(guò)對(duì)三次重復(fù)使用的效果分析，可以發(fā)現(xiàn)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對(duì)ZEA毒素有高效的吸附能力，毒素的解吸效果良好，可以實(shí)現(xiàn)較高回收率且具有可多次重復(fù)性使用的優(yōu)點(diǎn)。

表2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠重復(fù)使用3次的吸附及洗脫情況

2.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠添加回收率評(píng)價(jià)

按照1.3.4.1和1.3.4.3的方法，選擇c樣品玉米粉進(jìn)行ZEA毒素的添加回收率實(shí)驗(yàn),添加回收率計(jì)算公式見(jiàn)(3)，添加水平分別為30、60、90 μg/kg，每個(gè)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3，C樣品玉米粉3個(gè)水平的添加回收率在84.61%～90.00%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求，說(shuō)明制備的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠能用于實(shí)際樣品的純化。

(3)

式中：P表示ZEA毒素的添加回收率，m2為25 g樣品添加標(biāo)品后檢測(cè)到的ZEA毒素總質(zhì)量，m1為25 g樣品本底ZEA毒素質(zhì)量，m為25 g樣品中添加的ZEA毒素標(biāo)品質(zhì)量。

表3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠純化C樣品中ZEA毒素的添加回收率

2.4 DZTMS-PREP免疫親和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的實(shí)際應(yīng)用效果比較

按照1.3.4.1的方法分別對(duì)市面上6種玉米粉中ZEA毒素進(jìn)行提取，然后分別采用1.3.4.2和1.3.4.3對(duì)6種樣品提取液中ZEA毒素進(jìn)行純化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按照1.3.3方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4，通過(guò)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠和DZTMS-PREP免疫親和柱兩種前處理方式分別對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行純化，結(jié)果顯示采用兩種前處理方式檢測(cè)到的ZEA毒素在樣品中的分布規(guī)律是一致的，說(shuō)明制備的ZEA單抗磁珠有較好的使用效果。

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017[24]規(guī)定，玉米粉中玉米赤霉烯酮ZEA的限量指標(biāo)是60 μg/kg，所以6種樣品中b樣品ZEA含量超標(biāo)。

表4 免疫親和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠兩種方法對(duì)6種玉米粉純化后ZEA毒素的檢測(cè)結(jié)果

注：x為平均值；y為標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)論

本研究將金屬有機(jī)框架材料制備簡(jiǎn)單、可以固定抗體的特性和Fe3O4納米磁珠便于收集的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)對(duì)磁珠包覆技術(shù)的研究，將偶聯(lián)了ZEA單抗的金屬有機(jī)框架材料AMP&ZnCl2成功包覆在Fe3O4納米磁珠表面，制備了一種新型的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠。通過(guò)電鏡和紅外兩種表征方法對(duì)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的進(jìn)行了鑒定。驗(yàn)證并確定了制備的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的ZEA毒素負(fù)載量為3 μg/100 mg左右，隨著使用次數(shù)增加，負(fù)載量會(huì)有所下降。使用Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對(duì)c樣品玉米粉進(jìn)行了3個(gè)水平的添加回收率實(shí)驗(yàn)，該樣品的添加回收率在84.61%～90.00%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求。最后選擇了6種玉米粉，與免疫親和柱的純化效果進(jìn)行比較，從結(jié)果可以看出Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠對(duì)樣品的純化效果和免疫親和柱的純化效果基本相同。因此，F(xiàn)e3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠的制備是成功的，且具有良好的使用效果，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的純化。