凹凸棒石緩解熱處理豆粕對(duì)肉雞氧化應(yīng)激的研究

王 坤 裴付偉 程業(yè)飛 杜明芳 何青芬 陳躍平 溫 超 周巖民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)分子在活性氧(ROS)或次生氧化產(chǎn)物作用下導(dǎo)致共價(jià)結(jié)構(gòu)修飾的過(guò)程[1]。氧化會(huì)引起蛋白質(zhì)中部分氨基酸構(gòu)象改變[2]，溶解度和疏水性等物理性質(zhì)[3]及蛋白質(zhì)消化率發(fā)生變化[4]。蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，降低對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，影響動(dòng)物健康[5]。蛋白質(zhì)受到ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)、紫外光照射、金屬催化和高溫?zé)崽幚頃r(shí)易發(fā)生氧化[6-7]。豆粕是肉雞飼料中最常用的蛋白質(zhì)原料[8]，豆粕在生產(chǎn)過(guò)程中受擠壓膨化預(yù)處理、脫溶等高溫影響及長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)其蛋白質(zhì)均可能發(fā)生氧化。吳大偉等[9]研究表明，豆粕經(jīng)60 d常溫儲(chǔ)存和100 ℃條件下加熱處理8 h后羰基含量均顯著升高，巰基含量顯著降低，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。采食熱處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化的豆粕、大豆分離蛋白或小麥多肽后，動(dòng)物生長(zhǎng)受阻，抗氧化功能下降[10-11]。由于熱處理方法操作簡(jiǎn)便易行，目前研究蛋白質(zhì)氧化時(shí)，常采用100 ℃加熱處理使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。

凹凸棒石是一種具有特殊纖維晶體結(jié)構(gòu)的含水富鎂鋁硅酸鹽礦物，具有較大的比表面積、較強(qiáng)的吸附能力、良好的流變性和催化性等性質(zhì)，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域[12]。凹凸棒石可作為原料或添加劑應(yīng)用于飼料中。研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加凹凸棒石可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)、改善腸道健康、促進(jìn)養(yǎng)分利用率[13-14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，凹凸棒石因具有吸附性可以穩(wěn)定羥自由基從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成[15]、提高機(jī)體抗氧化能力[16-17]。然而，有關(guān)凹凸棒石緩解熱處理豆粕對(duì)肉雞氧化應(yīng)激的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)采用100 ℃條件加熱8 h處理豆粕，使其蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，代替正常豆粕并在熱處理豆粕日糧中添加凹凸棒石，研究其對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)和抗氧化功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理方法

豆粕：羰基含量7.57 nmol/mg蛋白、巰基含量8.30 nmol/mg蛋白。參照Tang等[5]的方法，將豆粕在100 ℃條件干熱處理8 h測(cè)得其羰基含量為11.92 nmol/mg蛋白、巰基含量為7.31 nmol/mg蛋白，與正常豆粕相比羰基含量增加，巰基含量降低，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將144只1日齡健康愛(ài)拔益加(AA)肉雞隨機(jī)分成3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只(公母各半)，分別飼喂以下3種日糧。1)對(duì)照組：肉雞飼喂正常豆粕配制的基礎(chǔ)日糧； 2)實(shí)驗(yàn)1組：肉雞飼喂100 ℃加熱處理8 h的豆粕配制的基礎(chǔ)日糧；3)實(shí)驗(yàn)2組：肉雞飼喂實(shí)驗(yàn)1組日糧+1%凹凸棒石。實(shí)驗(yàn)在南京市康欣禽業(yè)有限公司進(jìn)行，為期42 d，其中1～21 d為實(shí)驗(yàn)前期，21～42 d為實(shí)驗(yàn)后期。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)肉雞采用層疊籠飼養(yǎng)，每籠為一重復(fù)，24 h光照，每天喂料2次，自由采食和飲水，以重復(fù)為單位記錄每天采食量和死淘情況，免疫及消毒按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ZKSY-600智能恒溫型水浴鍋；5804R型臺(tái)式低溫離心機(jī)；PK-02200D型勻漿機(jī)。

1.4 樣品的采集

于實(shí)驗(yàn)21、42 d時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選取1只體重相近、健康狀況良好的公雞禁飼12 h(不禁水)，然后稱(chēng)重、屠宰。從頸動(dòng)脈處放血，采集血液于離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心15 min，分裝制備的血清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。待雞死亡后剖開(kāi)腹腔采集肝臟，分離腸段，用載玻片刮取空腸和回腸黏膜于潔凈凍存管中，液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平/g/kg

注：預(yù)混料可為每千克日糧提供: VA 10 000 IU，VD32 000 IU，VE 30 IU，VK31.3 mg，VB12.2 mg，VB28 mg，VB64 mg，VB120.013 mg，煙酸40 mg，氯化膽堿400 mg，D-泛酸鈣10 mg，生物素0.04 mg，葉酸1 mg，F(xiàn)e 80 mg，Cu 7.5 mg，Mn 110 mg，Zn 65 mg，I 1.1 mg，Se 0.3 mg。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

于實(shí)驗(yàn)第1、21、42天以重復(fù)為單位對(duì)肉雞進(jìn)行空腹稱(chēng)重，準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)各階段采食量，用于計(jì)算肉雞平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.5.2 血清生化指標(biāo)

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)含量，血清白蛋白(GLB)為血清總蛋白和白蛋白含量的差值。

1.5.3 抗氧化指標(biāo)

稱(chēng)取0.3 g左右的肝臟、空腸黏膜和回腸黏膜，加入9倍體積預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水，在冰浴中勻漿至無(wú)明顯塊狀物，然后將勻漿液在4 ℃、4 000r/min離心15 min，分裝上清液并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒄赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)測(cè)定血清、肝臟、空腸黏膜和回腸黏膜總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及丙二醛(MDA)和羰基(PC)含量，測(cè)定所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用單因子方差(One-Way ANOVA)分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，組間差異用鄧肯氏(Duncan’s)法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為顯著水平，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，飼喂氧化豆粕提高了肉雞前期和全期F/G(P<0.05)，添加凹凸棒石后，上述指標(biāo)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)。此外，與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1組相比，添加凹凸棒石提高了肉雞前期A(yíng)DG(P<0.05)。

表2 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞生產(chǎn)性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)右上角小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，下表同。

2.2 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞血清生化指標(biāo)的影響

如表3所示，肉雞血清生化指標(biāo)中TP、ALB、TC、TG、GLU和GLB的組間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞血清生化指標(biāo)的影響

2.3 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞血清抗氧化能力的影響

由表4可見(jiàn)，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組相比，凹凸棒石的添加可顯著降低21 d血清MDA含量(P<0.05)。與實(shí)驗(yàn)1組相比，添加凹凸棒石顯著降低了42 d血清MDA含量(P<0.05)。

表4 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕

2.4 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞肝臟抗氧化能力的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，飼喂熱處理豆粕提高了肉雞42 d肝臟的PC含量(P<0.05)，添加凹凸棒石后，其含量恢復(fù)至正常水平(P>0.05)。此外，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組相比，添加凹凸棒石可顯著提高肉雞21、42 d肝臟T-SOD活性(P<0.05)。

表5 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕蛋白質(zhì)肉雞肝臟

2.5 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞空腸黏膜抗氧化能力的影響

如表6所示，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組相比，添加凹凸棒石顯著降低肉雞21 d空腸黏膜的PC含量(P<0.05)，但對(duì)42 d空腸黏膜的PC及21、42 d空腸黏膜的MDA、T-SOD、T-AOC均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表6 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞

2.6 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞回腸黏膜抗氧化能力的影響

如表7所示，與對(duì)照組相比，飼喂熱處理豆粕提高了肉雞21 d回腸黏膜PC含量(P<0.05)，添加凹凸棒石后，上述指標(biāo)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)。

表7 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂氧化豆粕蛋白質(zhì)肉雞

但對(duì)42 d回腸黏膜的PC及21、42 d回腸黏膜的MDA、T-SOD、T-AOC均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3 討論

3.1 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞生產(chǎn)性能和血清生化指標(biāo)的影響

蛋白質(zhì)是飼料中最重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，蛋白質(zhì)品質(zhì)與飼料的消化、吸收及動(dòng)物機(jī)體的健康密切相關(guān)[18]。Lu等[19]研究表明，肉雞攝入氧化豆粕后，其后期和全期的F/G顯著升高、ADG顯著降低。本研究結(jié)果顯示，熱處理后氧化豆粕顯著降低肉雞前期和全期的F/G。Wu等[20]和Zhang等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，氧化蛋白可降低肉雞生產(chǎn)性能。蛋白質(zhì)經(jīng)氧化修飾后，其化學(xué)基團(tuán)、空間結(jié)構(gòu)和特殊構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化，從而可能對(duì)其在體內(nèi)的消化吸收有負(fù)面影響，進(jìn)而降低生產(chǎn)性能。本研究中，日糧中添加凹凸棒石可降低肉雞前期和全期F/G，提高肉雞前期A(yíng)DG。Zhang等[21]研究指出，添加凹凸棒石可顯著提高肉雞的ADG。Tang等[22]報(bào)道，凹凸棒石可促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)。凹凸棒石具有較大的比表面積和吸附能力，可通過(guò)吸附腸道內(nèi)NH3等有害物質(zhì)改善機(jī)體消化道微生態(tài)環(huán)境和機(jī)能[23-24]；同時(shí)凹凸棒石能夠增加胃腸道黏膜糖蛋白的分泌[25]，促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞增殖、再生和修復(fù)[26]，從而促進(jìn)腸道發(fā)育。因此，本實(shí)驗(yàn)中凹凸棒石可以改善攝入熱處理豆粕肉雞生產(chǎn)性能可能與凹凸棒石間接的促生長(zhǎng)作用相關(guān)。

研究表明，蛋白氧化會(huì)降低肉雞血清GLU含量[19]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能與飼養(yǎng)環(huán)境和管理措施的差異有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，日糧中添加凹凸棒石未影響血清生化指標(biāo)，這與Zhang等[21]和Chen等[17]結(jié)果相一致。

3.2 日糧中添加凹凸棒石對(duì)飼喂熱處理豆粕肉雞抗氧化能力的影響

蛋白質(zhì)羰基是由活性氧氧化氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基生成的氨和羰基衍生物，其含量可作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化程度的一項(xiàng)敏感指標(biāo)[27]。T-SOD是機(jī)體清除自由基的主要抗氧化酶之一，MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的一類(lèi)較穩(wěn)定的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其含量可反映機(jī)體的抗氧化性能。T-AOC可反映機(jī)體清除自由基的能力，也是反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)的敏感指標(biāo)[28]。吳秋萍[29]研究表明，飼喂加熱氧化蛋白可顯著降低小鼠血漿及肝臟、空腸十二指腸、肌肉等組織T-AOC及T-SOD的活力，并顯著增加MDA含量。本研究結(jié)果顯示，熱處理氧化豆粕顯著提高了肉雞42 d肝臟和21 d回腸黏膜的PC含量。同樣，Zhang等[11]研究表明，飼喂氧化大豆分離蛋白可顯著提高肉雞血清中MDA和PC含量及空腸黏膜中PC的含量。氧化蛋白可能增加活性氧的含量并引起肉雞氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制機(jī)體的抗氧化能力。本研究中，日糧中添加凹凸棒石顯著降低21、42 d血清MDA和21 d空腸黏膜PC的含量，顯著提高21、42 d肝臟T-SOD的活性。羅有文等[30]研究表明，日糧中添加凹凸棒石，可顯著提高肉雞血漿中T-SOD的活性，降低血漿、肝臟中MDA的含量。張磊[14]研究表明，日糧中添加凹凸棒石，可顯著降低肉雞空腸和回腸黏膜中MDA的含量，顯著提高回腸黏膜中T-SOD的活性及T-AOC。飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的改變、病原微生物、抗原、毒素、氧化油脂及礦物質(zhì)元素缺乏等均能引起機(jī)體的氧化應(yīng)激[31-32]。而凹凸棒石良好的吸附性能夠吸附毒素、致病微生物、重金屬及毒性抗原等，緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激[33]。凹凸棒石的表面活性位點(diǎn)硅羥基可吸附自由基，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物形成、防止脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[15]。凹凸棒石可能是通過(guò)吸附導(dǎo)致氧化應(yīng)激的成分及自由基而提高肉雞抗氧化能力。另外，凹凸棒石可增強(qiáng)的腸道免疫力、完整性和屏障功能，也可間接改善抗氧化能力。

4 結(jié)論

熱處理豆粕(100 ℃加熱8 h)顯著降低肉雞的料重比，并對(duì)機(jī)體造成一定的氧化損傷，添加1%凹凸棒石可改善攝入熱處理豆粕肉雞的生產(chǎn)性能并提高其抗氧化能力。