李瑞東 王力軍
(邢臺醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院內(nèi)科,河北 邢臺 054000)
世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示,每年肝病患者死亡的人數(shù)約100萬,其中有3%~6%的人會發(fā)展成為肝癌〔1,2〕。肝纖維化是一種發(fā)生于肝臟的炎癥反應(yīng),主要由肝炎病毒、血吸蟲病、酒精、藥物及毒物等長期持續(xù)損害肝臟,引起肝臟結(jié)締組織過度增生及異常沉積,最終引起肝臟正常結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化和肝功能障礙〔3〕。肝纖維化的病理變化過程是可以預(yù)防和阻斷的。因此,如何預(yù)防、治療及逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程是肝病研究領(lǐng)域的熱點之一。目前,肝纖維化常用西藥和中藥進行治療,但西藥特異性較差,中藥的治療效果較好,具有較好的應(yīng)用前景,但其作用機制尚不完全清楚〔4,5〕?;瘽峥估w保肝湯具有解毒化濁、清熱利濕、益氣扶正、養(yǎng)血生血的功效,對肝纖維化的發(fā)展具有重要作用。本研究通過制備肝纖維化大鼠模型,分析化濁抗纖保肝湯對其肝功能和肝纖維化指標的影響及作用機制。
1.1實驗動物 SD雄性大鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,體重110~130 g,單獨飼喂于室溫20~22℃、相對濕度60%的環(huán)境中,自由采食和飲水。
1.2實驗試劑 化濁抗纖保肝湯由黃芪、黃連、紅景天、三棱、田基黃、茵陳、絞股藍、鱉甲、虎杖等組成。方劑水煎將生藥濃縮至1.5 g/ml。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR mix 購自北京康為世紀有限公司,Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體、Bax兔抗鼠單克隆抗體、增殖細胞核抗原Ki-67兔抗鼠單克隆抗體購自美國Sigma公司;二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;透明質(zhì)酸酶(HA)放射免疫試劑盒、層黏連蛋白(LN)放射免疫試劑盒購自北京海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心。
1.3實驗方法
1.3.1實驗分組 健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組,每組10只。
1.3.2造模及給藥處理 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組大鼠給予未經(jīng)滅活的豬血清按0.5 ml/kg經(jīng)腹腔注射,每周2次,連續(xù)6 w。同時模型組、保肝湯1組按0.5 ml·kg-1·d-1給予蒸餾水、化濁抗纖保肝湯濃縮劑灌胃,持續(xù)給藥至第9周;保肝湯2組、保肝湯3組分別在造模第3周和第6周按0.5 ml·kg-1·d-1給予化濁抗纖保肝湯濃縮劑持續(xù)給藥至第9周。對照組按0.5 ml/只經(jīng)腹腔注射生理鹽水,每周2次,連續(xù)6 w,同時經(jīng)灌胃給予蒸餾水至第9周。
1.3.3肝功能指標的檢測 實驗結(jié)束前24 h,各組大鼠禁食24 h,10%水合氯醛麻醉大鼠,剖腹經(jīng)下腔靜脈采血,分離血清,全自動生化分析儀分析肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。
1.3.4肝纖維化的檢測 實驗結(jié)束前24 h,各組大鼠禁食24 h,10%水合氯醛麻醉大鼠,剖腹經(jīng)下腔靜脈采血,放射法檢測HA、LN指標。
1.3.5細胞增殖與凋亡相關(guān)基因的檢測 采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測肝組織中Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA的水平。利用Primer5.0軟件設(shè)計Bcl-2、Bax、Ki-67引物序列,由上海生物工程有限公司合成,Bcl-2上游序列為5′-CCGAGAGGTCTTCTTCCGTGTG-3′,下游序列為5′-GCCTCAGCCCATCTTCTTCCA-3′,Bax上游序列為5′-CAAGCCGGGAGAACAGGGTA-3′,下游序列為5′-CCCACCGAACTCAAAGAAGGC-3′。Ki-67上游序列為5′-GGACTCGCAGTTTGAGAAGG-3′,下游序列為5′-TGCAAATGTCC TCGTTTCTG-3′。100 mg肝組織加入1 ml TRIzol裂解液提取總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,GAPDH為參照,進行擴增。反應(yīng)體系為25 μl,反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 90 s,變性94℃ 30 s,退火58℃/57℃ 30 s,延伸72℃ 60 s,終延伸72℃ 5 min,35個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析儀進行分析,與GAPDH產(chǎn)物掃描量的比值為目的基因的相對表達量。
1.3.6細胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白的檢測 Western印跡法檢測肝組織中Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平。取出肝組織100 mg,加入500 μl預(yù)冷的蛋白裂解液,冰浴中超聲震碎,12 000 r/min離心1 h,收集上清。調(diào)整蛋白濃度,取100 μl樣本蛋白按1∶1的比例加入2倍樣品緩沖液,100℃加熱5 min。清洗玻璃板,配置10%的分離膠和4%的濃縮膠,將分離膠加入玻璃板,加入去離子水,靜置至完全聚合,加入濃縮膠,插入樣品梳。加樣,濃縮膠75 V電泳,分離膠120 V電泳。200 mA將蛋白轉(zhuǎn)至大小適中的硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h,加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗溶液,4℃孵育過夜,TBST漂洗3次×5 min,加入TBST稀釋二抗,37℃孵育30 min,TBST漂洗3次×5 min,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)液,曝光,顯影、定影,凝膠成像系統(tǒng)記錄蛋白質(zhì)的灰度值,并進行分析。
1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。
2.1各組肝功能指標比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組大鼠血清ALT、AST的水平均顯著高于對照組;保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清ALT、AST的水平均顯著低于模型組;保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清ALT、AST水平顯著升高;保肝湯3組較保肝湯2組血清ALT、AST水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。
2.2各組肝纖維化指標比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清肝纖維化指標HA、LN水平均顯著高于對照組;保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組血清HA、LN的水平均顯著低于模型組;保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清HA、LN水平顯著升高;保肝湯3組較保肝湯2組血清HA、LN水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見表2。
表1 各組肝功能指標水平比較
與對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01;與保肝湯1組比較:3)P<0.01;與保肝湯2組比較:4)P<0.01,下表同
表2 各組肝纖維化指標水平比較
2.3各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67 mRNA水平均顯著高于對照組;保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Ki-67 mRNA水平均顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),Bax mRNA水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組血清Bcl-2、Ki-67mRNA水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),Bax mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);保肝湯3組較保肝湯2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。
表3 各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較
2.4各組細胞增殖與凋亡相關(guān)基因蛋白水平比較 模型組、保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平均顯著高于對照組;保肝湯1組、保肝湯2組、保肝湯3組肝組織Bcl-2、Ki-67蛋白水平均顯著高于模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),Bax蛋白水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);保肝湯2組、保肝湯3組較保肝湯1組肝組織Bcl-2、Ki-67蛋白水平顯著降低差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),Bax水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);保肝湯3組較保肝湯2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1和表4。
圖1 各組肝組織Bcl-2、Bax、Ki-67蛋白水平比較
組別Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHKi-67/GAPDH對照組0.351±0.0450.343±0.0420.532±0.067模型組0.463±0.0251)0.722±0.0581)0.863±0.0691)保肝湯1組0.859±0.0331)2)0.718±0.0851)1.863±0.2591)2)保肝湯2組0.693±0.0711)2)3)0.698±0.0911)1.332±0.1751)2)3)保肝湯3組0.688±0.0971)2)3)0.713±0.0851)1.247±0.2631)2)3)F值112.47249.22271.943P值0.0000.0000.000
肝纖維化是由多種因素引起的慢性肝炎反應(yīng),可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種慢性肝病,也是肝硬化的必經(jīng)途徑〔6〕。豬血誘導(dǎo)制備大鼠肝纖維化模型,其肝臟病理改變與人臨床肝纖維化癥狀相似,是研究肝纖維化常用的動物模型。目前,ALT、AST是國內(nèi)外肝功能損害的常用檢測標準〔7〕。ALT主要存在于細胞質(zhì),AST在肝細胞線粒體內(nèi)的含量較高,在急性肝損傷中常用ALT為指標,但AST的含量反映肝細胞的損傷程度〔8〕。當發(fā)生慢性肝炎等疾病時,肝細胞膜的損傷較為嚴重,線粒體則基本完整,ALT穿過細胞質(zhì)進入血液;肝細胞線粒體受損嚴重時,則導(dǎo)致大量AST進入血液〔9〕。因此,在肝功能異常時,血清中ALT、AST的水平反映肝功能的受損程度。肝纖維化發(fā)生時,HA隨著肝纖維化的程度而逐漸升高;當肝纖維化程度減弱時,HA的水平之間下降〔10〕。因此常用血清中HA的含量作為肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的指標。LN是基底膜透明層的主要成分,與肝組織的病理變化有顯著相關(guān)性,其血清中的含量常被用來檢測肝纖維增生的敏感指標〔11〕。本研究結(jié)果提示化濁抗纖保肝湯具有緩解肝纖維化的作用,且作用越早效果越佳,與前期的研究結(jié)果一致〔12〕。肝纖維化由多種原因產(chǎn)生,人們認為細胞的增殖與凋亡是預(yù)防和治療肝纖維化的重要因素之一〔13,14〕。細胞的凋亡過程由多種基因進行調(diào)控,是一個復(fù)雜的過程。其中Bcl-2家族被認為與細胞的凋亡過程密切相關(guān)。Bcl-2通過調(diào)控細胞色素C與凋亡相關(guān)因子的分泌,調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體參與細胞的凋亡過程。研究表明,當Bax的表達量增加可促進細胞凋亡的發(fā)生〔15〕。當Bcl-2過表達,形成異源二聚體的反應(yīng)增加,降低游離狀態(tài)Bax的水平,抑制細胞的凋亡;當Bax過表達,形成同源二聚體的反應(yīng)增加,發(fā)揮促凋亡的作用。Ki-67分布于細胞周期除G0期以外的其他任何時期,具有半衰期短的特點,在細胞完成有絲分裂后快速降解和失去抗原決定簇,因此常被用來反映細胞增殖活性的敏感指標〔16〕。本研究結(jié)果表明化濁抗纖保肝湯參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,主要通過促進肝細胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡。