依達拉奉對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經元自噬及凋亡的影響

劉瑤 劉俊杰 吳寅秋 吳娟 杜鵑 王雪 李建民 趙雅寧

(華北理工大學 1護理與康復學院，河北 唐山 063000；2臨床醫(yī)學院)

依達拉奉作為一種有效的自由基清除劑，通過抑制羥基自由基依賴性和自由基非依賴性的過氧化脂質的產生發(fā)揮抗氧化劑的作用〔1〕。依達拉奉作為一種神經保護劑，除了能降低自由基的濃度外，還有抗腦水腫及神經保護功能，現(xiàn)已逐步應用到蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的治療過程中。SAH是臨床上一種常見的腦血管疾病，多見于創(chuàng)傷和腦動脈瘤破裂〔2〕，在急性腦血管病中大概占10%，發(fā)病率和死亡率超過50%〔3〕，已經成為人類致殘、致死的主要疾病之一。目前研究證實，SAH后盡早地減少出血后神經細胞凋亡數(shù)目，降低死亡率，是治療關鍵〔4〕。SAH后產生大量自由基，引起凋亡信號被激活，介導細胞凋亡的過程，造成腦組織不可逆損害。低水平的自噬可以減輕細胞凋亡，減輕SAH后早期腦損傷〔5〕。但依達拉奉在SAH后對神經細胞凋亡的作用機制是否與自噬有關還不清楚。本實驗擬從自噬層面上探討依達拉奉對SAH后神經元凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 依達拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，國藥準字H20050280)；3-甲基腺嘌呤溶液(上海偉進生物科技有限公司)；多克隆Beclin-1、LC3-Ⅱ抗體(SantaCruz公司)；二抗及顯色用品(美國KPL公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白質定量試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；石蠟切片機(德國LEICA)。

1.2分組及模型制作 清潔級雄性SD大鼠24只，體質量350～450 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術組、SAH組、3-甲基腺嘌呤組(3-MA組)和依達拉奉組(Edr組)，每組6只。參考文獻〔6〕采用血管穿刺法制備大鼠SAH模型。大鼠稱重后使用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采取頸部前正中切口，夾閉頸總動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，剪斷其遠心端，將尼龍線斜插入頸內動脈，到達顱內。造模成功參考指標：手術中出現(xiàn)呼吸急促，心率加快；麻醉清醒后精神萎靡，嗜睡、畏光等。大鼠麻醉清醒后以5 mg/kg劑量、通過腹腔注射法注射相應溶劑，即SAH組注射生理鹽水、3-MA組注射3-MA溶液、Edr組注射依達拉奉。假手術組手術操作與SAH組相同，但不刺破大腦血管，聯(lián)合腹腔注生理鹽水。

1.3HE染色 術后24 h，10%水合氯醛深度麻醉大鼠后打開胸腔，經心臟灌注生理鹽水至大鼠肝臟發(fā)白，隨后改用4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，置于甲醛溶液內保存?？v切取視交叉至大腦橫裂區(qū)域腦組織，行常規(guī)石蠟包埋、切片(片厚5 μm)、HE染色，脫水封片。光鏡下觀察海馬CA1區(qū)細胞的病理變化。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野，計算存活與死亡細胞數(shù)并得出均值。

1.4免疫組織化學染色 行常規(guī)脫蠟水化，過氧化氫避光孵育10 min，胰酶抗原修復20 min，滴加Beclin-1多克隆抗體(1∶200稀釋)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶300稀釋)置于濕盒中4℃冰箱過夜；第二步滴加二抗置于37℃溫箱孵育30 min，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、脫水、透明、封片。實驗采用PBS代替一抗，作為陰性對照。光鏡下觀察海馬CA1區(qū)陽性細胞的表達情況。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野(400×)，計算陽性細胞數(shù)并得出均值。

1.5細胞凋亡檢測 切片進行常規(guī)脫蠟、預處理組織后，使用過氧化氫室溫封閉10 min；PBS洗滌，隨后滴加平衡緩沖液，風干多余液體立即滴加工作強度轉移酶充分覆蓋組織，并置于濕盒中溫箱孵育1 h，加入停止/洗滌緩沖液；最后滴加抗地高辛氧化酶經室溫孵育30 min后，滴加DAB顯色、脫水、透明、封片。光鏡下TUNEL陽性產物主要位于細胞核。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野，計算陽性細胞數(shù)并得出均值。

1.6統(tǒng)計學分析 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和SNK檢驗。

2 結 果

2.1CA1區(qū)神經細胞觀察 假手術組海馬區(qū)神經元鏡下形態(tài)規(guī)則、分層排列整齊，胞質均勻，胞核界限清晰，核仁明顯；SAH組海馬區(qū)神經元鏡下形態(tài)呈不規(guī)則錐形、交錯排列，核膜裂解、核固縮和溶解、核仁消失；相比于SAH組，3-MA組病理損傷明顯增重，損傷神經元數(shù)量增加、核固縮和核溶解明顯加重；相比于SAH組，Edr組細胞損傷明顯減輕，損傷神經元數(shù)目減少，核固縮、核碎裂和核溶解現(xiàn)象明顯減輕，但較假手術組損傷依然嚴重。見圖1、表1。

2.2細胞凋亡檢測 TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細胞形態(tài)學特征示胞體縮小，染色質凝集，密度增高，胞核中棕色顆粒。SAH組凋亡細胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)；相比于SAH組，3-MA組凋亡細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，Edr組凋亡細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術組(P<0.05)。見表1。

2.3免疫組織化學染色 假手術組鏡下視野未見陽性細胞或個別散在分布，Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3均不表達或極低水平表達；相比于假手術組，SAH組Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3蛋白陽性細胞明顯增加(P<0.05)；相比于SAH組，3-MA組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞顯著減低，但仍顯著高于假手術組(P<0.05)，而3-MA組Caspase-3蛋白陽性細胞明顯增加(P<0.05)，Edr組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞升高(P<0.05)，而Caspase-3蛋白陽性細胞明顯降低(P<0.05)；相比于3-MA組，Edr組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白陽性細胞明顯降低(P<0.05)。見表2，圖2。

圖1 各組神經元細胞染色(HE，×400)

組別存活細胞數(shù)凋亡細胞數(shù)假手術組122.17±2.4814.00±2.53SAH組73.33±1.971)63.50±2.431)3-MA組69.50±2.352)67.17±2.861)2)Edr組85.17±2.401)2)51.50±1.641)2)

與假手術組比較:1)P<0.05；與SAH 組比較:2)P<0.05

表2 各組海馬CA1區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3 陽性 細胞數(shù)的比較個/HP,n=6)

圖2 各組海馬 CA1 區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3染色(DAB，×400)

3 討 論

SAH發(fā)病初期病死率約為40%，30%的幸存者會遺留嚴重神經功能障礙〔7〕。SAH后通常會出現(xiàn)的并發(fā)癥是腦血管痙攣，是造成患者死亡常見的原因之一。SAH 發(fā)生后血凝塊溶解釋放的氧合血紅蛋白，會產生大量活性氧自由基和脂質過氧化物，誘導自由基反應，引起和加重腦血管痙攣〔8〕。隨著對SAH研究的進展，大多數(shù)入院的患者不會再次出血，由于早期腦損傷的分子機制及信號通路十分復雜，尚未找到一種有效手段可以預防或減輕腦組織細胞的早期損傷。作為經典的氧自由基清除劑，依達拉奉能改善皮質水腫、可抑制脂質過氧化、有效消除自由基；因此，臨床上被用作急性腦缺血神經保護劑；近年來，其已逐漸用于SAH的早期治療。在SAH治療的過程中，依達拉奉以其強大的自由基清除功能及抑制脂質過氧化反應，起到防治腦血管痙攣，發(fā)揮腦保護作用〔9〕。本研究提示依達拉奉具有減輕SAH所致細胞凋亡的作用。

細胞自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、細胞內成分和結構更新的正常途徑，調控蛋白和細胞器的降解利用，參與細胞質的重建，是保持完整細胞器和大分子蛋白降解的主要途徑，因此自噬在維持細胞的自我穩(wěn)態(tài)、適應內外環(huán)境的變換及自身發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。自噬在神經系統(tǒng)的調控作用與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關〔10，11〕。Lee等〔12〕在大鼠SAH模型上發(fā)現(xiàn)受損的神經元中Beclin-1、LC3-Ⅱ均表達升高，提示自噬可能參與自發(fā)性SAH后的早期腦損傷。且有研究證實自噬激活在SAH后早期腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中引起神經元凋亡中發(fā)揮關鍵作用〔13〕。本研究結果顯示，依達拉奉可能是通過促進自噬的表達，對海馬區(qū)神經元的凋亡起到了一定的抑制作用。自噬和凋亡作為細胞死亡的兩種形式，二者之間有復雜的聯(lián)系〔14〕。自噬可清除破損線粒體，可能在一定程度上延遲了凋亡的發(fā)生，且起到對抗凋亡的作用〔15〕。本實驗從自噬層面上證實了依達拉奉有效的干預能激活自噬，減少細胞凋亡，起到神經保護作用。