血糖波動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α的影響

田翰林，常柏，田文靜

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2014年全球成年人群糖尿病(DM)發(fā)病率高達(dá)9%[1]，2015年國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)數(shù)據(jù)顯示，全球DM患病人數(shù)已達(dá)到4.15億，我國(guó)2015年DM患病人數(shù)居世界首位，高達(dá)1.1億[2]。同時(shí)DM大血管病變是公認(rèn)的高致殘疾病因素。近年中外研究發(fā)現(xiàn)，血糖波動(dòng)相較于單純性高血糖對(duì)血管內(nèi)皮損傷更為嚴(yán)重，具體機(jī)制尚不明確。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一個(gè)由α、β、γ亞基形成的三聚體，被稱(chēng)為細(xì)胞能量的“燃料開(kāi)關(guān)”“感受器”“低能警示系統(tǒng)”。受磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)比值調(diào)控，對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝極為敏感，同時(shí)影響生理性一氧化氮(NO)產(chǎn)生、caspase-3凋亡因子表達(dá)，從而影響血管內(nèi)皮的功能[3-4]；過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α(PGC-1α)作為AMPK的下游效應(yīng)分子，參與線粒體系統(tǒng)合成和個(gè)體合成的過(guò)程，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝[5]。本研究于2016年12月通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)高糖/血糖波動(dòng)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中AMPK、PGC-1α的蛋白表達(dá)與信使RNA(mRNA)表達(dá)，以探討血糖波動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮的影響。

1 材料與儀器

HUVECs(天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所)，DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibcu公司)，肝素鈉、明膠、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sigma公司)，AMPK，PGC-1α抗體，anti-β(CST公司)。顯微鏡、全自動(dòng)圖像分析儀(日本奧林巴斯公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)，臺(tái)式低/高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)，PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)HUVECs復(fù)蘇后用含10% 胎牛血清的5 mmol/L含葡萄糖和氨基酸(Glu DMEM)的低糖培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每24 h換液一次，每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代HUVECs，倒掉培養(yǎng)液，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以105/mL濃度接種于六孔板中，參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)血糖濃度、換藥時(shí)間以及分組模式，將細(xì)胞分為三組：正常組用5 mmol/L Glu DMEM培養(yǎng)液，每24 h換液一次(模擬正常糖環(huán)境)；高糖組用25 mmol/L Glu DMEM培養(yǎng)液(模擬高糖環(huán)境)，每24 h換液一次；血糖波動(dòng)組用25 mmol/L Glu DMEM培養(yǎng)液和5 mmol/L Glu DMEM培養(yǎng)液，每8 h交替更換一次培養(yǎng)液(模擬血糖波動(dòng)環(huán)境)，將三組模型置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行觀察。

2.2流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)HUVECs凋亡用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2 次，2 000 r/min離心5 min，收集1×105～5×105細(xì)胞；將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液500 μL，加入Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC)5 μL和核酸染料(PI)5 μL，輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm。用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置，每組做3個(gè)平行反應(yīng)。

2.3Westernblot檢測(cè)高糖及血糖波動(dòng)對(duì)AMPK和PGC-1α蛋白表達(dá)的影響取干預(yù)后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液5 min，12 000 r/min低溫離心15 min，聚氰基丙烯酸正丁酯試劑檢測(cè)法(BCA法)檢測(cè)總蛋白量，每樣品取20滴上樣，蛋白質(zhì)雙向電泳(DS-PAGE電泳)分離，轉(zhuǎn)膜，10 V恒壓通電80 min。加一抗：抗AMPK(1∶1 000稀釋)、抗PGC-1α(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性二抗(1∶2 000) 及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體(1∶1 000) 室溫下孵育1 h。顯影、定影、洗片。結(jié)果用凝膠成像軟件定量掃描條帶灰度，以目的蛋白條帶/β-acting蛋白條帶的比值反映各自的蛋白表達(dá)水平，每組取6個(gè)樣本測(cè)試。

2.4RT-PCR檢測(cè)高糖、血糖波動(dòng)對(duì)AMPK與PGC-1αmRNA表達(dá)影響將干預(yù)后的細(xì)胞，超純RNA提取試劑盒提取組織總RNA，引物序列：AMPK上游引物5′-TGGCAAACATGAATTGACTGG -3′；下游引物5′-GCTTGAGGTTCTGAATTTCTCTG-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度113 bp；PGC-1α上游引物：5′-AGAAGCGGGAGTC TGAAA GG-3′，下游引物：5′-CAGTTCTGTCCGCGTTGTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度 483 bp；用HiFi-MMLVcDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，60～95 ℃進(jìn)行融解曲線分析，目的基因和對(duì)照基因的Ct值經(jīng)熒光定量分析儀自動(dòng)采集給出，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)量，每組取6個(gè)樣本測(cè)試。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗(yàn))顯示：內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的4個(gè)指標(biāo)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)看：早晚期細(xì)胞凋亡指標(biāo)由高至低依次為血糖波動(dòng)組、高糖組、正常組；機(jī)械損傷細(xì)胞指標(biāo)由高至低依次為高糖組、血糖波動(dòng)組、正常組；存活細(xì)胞指標(biāo)由高至低依次為正常組、高糖組、血糖波動(dòng)組。

表1 高糖、血糖波動(dòng)對(duì)HUVECs凋亡率影響

注：兩兩比較顯著性標(biāo)記a、b分別為和正常組、高糖組比較，P<0.05

3.2各組內(nèi)皮細(xì)胞AMPK和PGC-1α相對(duì)蛋白表達(dá)的變化各組細(xì)胞AMPK和PGC-1α蛋白條帶圖見(jiàn)圖1，數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗(yàn))顯示：各組內(nèi)皮細(xì)胞AMPK和PGC-1α蛋白表達(dá)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)看：均以血糖波動(dòng)組為最低，正常組最高。

圖1 不同血糖水平下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞AMPK和PGC-1α蛋白的表達(dá)

3.3各組內(nèi)皮細(xì)胞AMPK和PGC-1α相對(duì)基因表達(dá)的變化數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗(yàn))顯示：細(xì)胞AMPK和PGC-1α相對(duì)基因表達(dá)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)看：兩基因表達(dá)水平都是血糖波動(dòng)組為最低，正常組最高。

表2 各組細(xì)胞AMPK和PGC-1α相對(duì)蛋白表達(dá)

注：兩兩比較顯著性標(biāo)記a、b分別為和正常組、高糖組比較P<0.05

表3 各組細(xì)胞AMPK和PGC-1α相對(duì)基因表達(dá)

注：兩兩比較顯著性標(biāo)記a、b分別為和正常組、高糖組比較,P<0.05

4 討論

高血糖可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)其分泌與釋放趨化因子、黏附分子等炎性介質(zhì)的平衡失調(diào)，以至于刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)；同時(shí)高糖可間接引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和脂代謝紊亂等病理反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，降低存活率，促進(jìn)凋亡。高糖環(huán)境亦可活化多元醇通路，增強(qiáng)己糖胺途徑，蛋白激酶C 激活等，導(dǎo)致改變細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞功能損害[7-8]。血糖波動(dòng)對(duì)血管功能造成損害是多途徑的，且其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷相較于單純性高糖更為嚴(yán)重[9-10]。本研究結(jié)果顯示，體外血糖波動(dòng)及持續(xù)高糖培養(yǎng)可誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生凋亡，且血糖波動(dòng)組凋亡率高于高糖組。

AMPK受AMP/ATP比值調(diào)控，氧化應(yīng)激、缺血缺氧、代謝產(chǎn)物等導(dǎo)致AMP/ATP比值升高的因素都可通過(guò)AMPKα1亞基172位蘇氨酸磷酸化或直接變構(gòu)激活A(yù)MPK。AMPK激活后，通過(guò)下游SIRT1/PGC-1α 信號(hào)途徑，引起線粒體氧化磷酸化能力增強(qiáng)，開(kāi)啟生成ATP產(chǎn)能的途徑[11]。AMPK也通過(guò)對(duì)游離脂肪酸(FFA)氧化的促進(jìn)從而拮抗FAA造成的內(nèi)皮細(xì)胞脂毒性，以此對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生保護(hù)[12]。AMPK通路中，其通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮-氧化氮合酶活性，刺激NO 的產(chǎn)生，改善內(nèi)皮功能[13-14]?；罨腁MPK 通過(guò)其下游的靶分子如組蛋白脫乙酰酶(SIRT1)、FOXO和PGC-1α抑制核因子-κB(NF-κB)信號(hào)，隨后降低炎性因子的表達(dá)[15]。高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞中caspase-3的活性在AMPK激活時(shí)可被抑制，從而減少細(xì)胞凋亡[16]。

PGC-1α作為AMPK的下游效應(yīng)分子，AMPK不僅能增加PGC-1α的表達(dá)，且直接能夠?qū)е缕淞姿峄诉^(guò)程是PGC-1α依賴(lài)性介導(dǎo)的PGC-1α的啟動(dòng)子激活所必需的。研究表明：細(xì)胞能量代謝中線粒體起著決定性作用，作為能量代謝最重要的場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增值、凋亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程直接參與。而線粒體的生成中PGC-1α可能是其關(guān)鍵調(diào)控因子，可對(duì)生物刺激調(diào)控線粒體表達(dá)與合成直接做出相應(yīng)反應(yīng)[17-18]。被PGC-1α調(diào)控的線粒體生成信號(hào)途徑可能是修復(fù)與維持血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能的一項(xiàng)主要機(jī)制[19]。

本研究中，在高糖及血糖波動(dòng)狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK和PGC-1α蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)都呈下降表現(xiàn)，而且血糖波動(dòng)狀態(tài)下的表達(dá)下降更為明顯，細(xì)胞凋亡率也更高，但具體損傷機(jī)制尚不明確，考慮與血糖波動(dòng)狀態(tài)下改變了內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝平衡，導(dǎo)致能量消耗異常以至于AMP/ATP比值改變，從而使AMPK激活減少，PGC-1α作為AMPK下游效應(yīng)分子表達(dá)下降，使得整個(gè)AMPK通過(guò)調(diào)節(jié)PGC-1α-核呼吸因子-1通路中激活編碼線粒體蛋白的核基因和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制異常，線粒體表達(dá)受到影響，內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)功能受損[20-21]。另一方面AMPK、PGC-1α表達(dá)減少也導(dǎo)致其相應(yīng)信號(hào)通路、合成代謝與分解代謝異常，生理性NO 的產(chǎn)生減少、炎性因子、caspase-3表達(dá)上升等自身防御機(jī)制異常，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。

綜上所述，本研究初步結(jié)果顯示，血糖波動(dòng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害程度高于持續(xù)高血糖，部分機(jī)制與其影響AMPK/PGC-1α相關(guān)通路及細(xì)胞能量代謝改變有關(guān)，確切機(jī)制值得進(jìn)一步探討。