血清鐵和鐵蛋白水平在海人酸誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中的意義

姚煥煥，路屹

癲癇是一種以自發(fā)性反復(fù)發(fā)作為特征的復(fù)雜性多因素疾病[1]。谷氨酸是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其特異性受體結(jié)合而介導(dǎo)神經(jīng)元興奮性傳遞，其含量的異常升高可誘發(fā)癲癇發(fā)作。很多癲癇病人腦內(nèi)可見谷氨酸—谷氨酰胺循環(huán)異常[2-3]。海人酸(KA)是腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，目前已廣泛用于癲癇發(fā)作的研究，許多學(xué)者將KA腹腔注射或立體定向腦室內(nèi)注射應(yīng)用[4-5]，誘導(dǎo)出的動物模型可出現(xiàn)類似于人類顳葉癲癇發(fā)作的臨床表現(xiàn)，同時腦內(nèi)還可見海馬硬化和形態(tài)改變，以及神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞活化等特征性病理的改變。鐵是生命體不可缺少的微量元素，參與多種生物代謝過程，如氧運輸、能量的生成、DNA及脂質(zhì)的合成等。人體內(nèi)鐵含量過多或過少都會影響各器官的正常功能活動。在兒童腦組織發(fā)育過程中，鐵缺乏嚴(yán)重將影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，引起兒童不可逆的行為和認(rèn)知障礙[6]；而鐵過量時，會導(dǎo)致神經(jīng)元的降解死亡，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂性疾病，例如帕金森病、阿爾茨海默病等[7]。目前有關(guān)癲癇的發(fā)病機(jī)制尚未明確，觀點不一，而對于鐵在癲癇及其病理生理意義的作用也知之甚少，本實驗選取KA誘導(dǎo)的與人類顳葉癲癇臨床表現(xiàn)及病理相似的癲癇動物模型，應(yīng)用原子吸收光譜儀測定血清鐵，采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測定血清鐵蛋白含量，初步探究微量元素鐵與KA誘導(dǎo)的癲癇之間的關(guān)系。

1 材料

1.1實驗動物無特定病原體動物(SPF)級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量270～370 g，2015年10月購自蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物房,2016年10月進(jìn)行實驗動物的處置并進(jìn)行研究，均完全符合實驗動物倫理學(xué)原則。

1.2藥品、試劑與儀器KA(合肥志宏生物技術(shù)有限公司，批號：H37022764)，水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，批號：H13024604)，地西泮(吉林濟(jì)邦藥業(yè)有限公司，批號：H14021957)，大鼠血清鐵及血清鐵蛋白試劑盒(合肥志宏生物技術(shù)有限公司，批號：S20083085)；Med4101生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠生產(chǎn))。Labsystems Finnpipette 100 μL單道移液器；Thermo 50 μL 8道移液器； HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

2 方法

2.1模型制備成年雄性SD大鼠30只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組和對照組，每組15只。模型組大鼠經(jīng)腹腔一次性注射KA 10 mg/kg，對照組腹腔注射0.9%生理鹽水35 mg/kg。注射后連續(xù)監(jiān)測大鼠4～5 h，觀察是否有癇性發(fā)作并進(jìn)行分級。給予持續(xù)癲癇性發(fā)作超過1 h的大鼠腹腔注射地西泮4 mg/kg，并給予皮下注射1 mL生理鹽水補(bǔ)液治療。癲癇性發(fā)作行為觀察，參照Racine標(biāo)準(zhǔn)，0級：無驚厥發(fā)作；Ⅰ級：面肉痙攣(其中包括咀嚼動作、抖動胡須、眨眼)，濕狗樣抖動；Ⅱ級：頸肌痙攣(表現(xiàn)為有節(jié)律性的點頭)；Ⅲ級：單側(cè)上肢陣攣；Ⅳ級雙側(cè)上肢陣攣，站立；Ⅴ級：跌倒，全身陣攣發(fā)作。其中Ⅰ～Ⅲ級屬于部分性發(fā)作，Ⅳ～Ⅴ級屬于全面性發(fā)作。

2.2腦電圖記錄每組按照隨機(jī)數(shù)字表法選取3只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)進(jìn)行麻醉。參照文獻(xiàn)[8]置電極，進(jìn)行腦電圖描記。采用Medlab生物信息采集系統(tǒng)描記兩組大鼠腦電圖，紙速5 mm/s,時間常數(shù)0.2，濾波50 Hz,放大倍數(shù)2 000，連續(xù)描記5 min。動物喂養(yǎng)室溫22～25 ℃專門實驗室喂養(yǎng)2個月，按時給食物和水，每2 d取不同時段連續(xù)監(jiān)測1 h，記錄實驗動物的行為學(xué)表現(xiàn)和存活情況。

2.3標(biāo)本采集分別于給藥前1周和給藥后2個月采用眼眶靜脈叢采血法采集靜脈血1 mL，離心，取上層血清。-30 ℃低溫冰箱保存。

2.4血清鐵測定標(biāo)本解凍，每組標(biāo)本取100 μL，在空白管中加入0.1 mL雙蒸水和0.3 mL鐵顯色劑；在標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.1 mL的2 mg/L鐵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和0.3 mL鐵顯色劑；在測定管中加入0.1 mL血清和0.3 mL鐵顯色劑，混勻。將測定管于沸水中煮5～10 min，其余兩組不煮，冷卻離心，取0.2 mL上清液，分別置于96孔板中，按說明書測各孔吸光度光密度(OD)值，記錄各組數(shù)值，按照以下計算公式計算血清鐵含量：

2.5測定血清鐵蛋白將標(biāo)本解凍后，每組標(biāo)本各取40 μL待測。(1)試劑盒室溫環(huán)境放置45 min，輕輕搖勻。(2) 稀釋與加樣:取5個分別標(biāo)記為N2、N3、N4、N5、N6的離心管，然后用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品原液按照1/32、1/16、1/8、1/4、1/2倍數(shù)稀釋成5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。(3)加樣：先分成空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔三組，其中空白孔不加樣本、生物素標(biāo)記的抗-FE抗體及鏈霉親和素-HRP；標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，鏈霉親和素-HRP 50 μL(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不需要另加)；待測樣品孔中加入40 μL的樣本，然后各加入10 μL的抗-FE抗體，50 μL的鏈酶親和素-HRP，按照要求加樣混勻后，蓋上封板膜后，于37 ℃環(huán)境溫育1 h。(4) 配液：以1∶20倍的比例稀釋濃縮洗滌液和新鮮醫(yī)用雙蒸水。(5)洗滌：棄去酶標(biāo)板上層液體，甩干，將每孔加滿洗滌液，靜置1 min后棄去，重復(fù)洗滌5～8次，用吸水紙將酶標(biāo)板輕輕拍干。(6) 顯色：每孔先后加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，混勻，37 ℃避光反應(yīng)15～20 min。(7) 終止：分別于每孔加50 μL終止劑，此時可見藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃，即終止反應(yīng)。(8) 測定OD。(9) 實驗數(shù)據(jù)計算：根據(jù)鐵蛋白試劑盒說明書計算樣本含量。

3 結(jié)果

模型組大鼠依次出現(xiàn)Ⅰ～Ⅴ級癇性發(fā)作，腦電圖出現(xiàn)大量癇性波，對照組無癇性發(fā)作，腦電圖描記無異常。模型組血清鐵、血清鐵蛋白含量分別為(3.502±0.475)mg/L、(29.229±1.912) μg/L，均明顯高于對照組的(2.408±0.760)mg/L、(23.449±1.711)μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.328、19.169，P=0.018 3、0.026 7)。給藥前對照組大鼠血清鐵和血清鐵蛋白含量分別為(2.474±0.412) mg/L、(23.107±6.684) μg/L，與模型組的(2.457±0.535)mg/L、(24.258±9.304)μg/L比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.632、5.184，P=0.786 1、0.591 0)。血清鐵、血清鐵蛋白與癲癇發(fā)作具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.633、0.732(P=0.035 0、0.013 9)。

4 討論

癲癇是一種由多病因引起的復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，全世界約有7 000萬癲癇病人，癲癇的發(fā)病率、患病率和病死率隨年齡、地點和時間的不同而變化，現(xiàn)有的診斷及治療方法還不夠完善，癲癇嚴(yán)重?fù)p害病人身體健康，降低生活質(zhì)量，引起一系列的精神心理問題，給個人及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。癲癇病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，神經(jīng)元的異常放電可能與離子通道異常，神經(jīng)遞質(zhì)的合成，神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡以及突觸聯(lián)系、遺傳及免疫等的異常有密切關(guān)系。臨床通過磁共振磁敏感加權(quán)成像(SWI)測量癲癇病人腦鐵含量時發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇病人大腦皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)鐵水平降低[9]，如黑質(zhì)、紅核、基節(jié)區(qū)，皮質(zhì)結(jié)構(gòu)鐵含量增加，腦鐵在皮質(zhì)及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了再分配。此外，皮質(zhì)和基底節(jié)鐵水平受癲癇發(fā)作年齡、發(fā)作持續(xù)時間各種致病因素的影響。

癲癇動物模型的制備方法不一，主要包括電點燃和化學(xué)點燃，其中戊四氮、匹羅卡品、KA及青霉素為常用的四種化學(xué)點燃藥物，腦內(nèi)立體注射和腹腔注射是常見的化學(xué)誘導(dǎo)癲癇動物模型的用藥方法。其中一次性腹腔注射KA誘導(dǎo)的癲癇動物模型，與人類顳葉癲癇的行為學(xué)表現(xiàn)和病理變化相似，制備方法簡單，是目前較為常用的癲癇模型制備方法。李欣等[10]發(fā)現(xiàn)KA誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬區(qū)線粒體呼吸鏈復(fù)合物生理功能明顯下降，而鐵參與氧化呼吸鏈復(fù)合物的形成，鐵的異常可能與KA誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作有關(guān)。同時已有證據(jù)表明腦內(nèi)鐵的改變和癲癇之間有密切聯(lián)系[11-12],將鐵或者氯化亞鐵注射至實驗動物大腦皮質(zhì)或海馬區(qū)，可導(dǎo)致實驗動物腦電和行為性癲癇發(fā)作，由此建立癲癇動物模型，同時在治療各種鐵過載疾病過程中，具有螯合鐵作用的姜黃素已被廣泛應(yīng)用于臨床[13]，與此同時，在實驗動物的研究中，姜黃素能有效抑制通過腦內(nèi)鐵注射所誘導(dǎo)的癲癇動物模型的癲癇發(fā)作和進(jìn)展[14]。

外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制與含鐵物質(zhì)沉積于腦組織引起的一系列病理變有緊密聯(lián)系[15]。鐵主要以游離及結(jié)合鐵的形式存在，鐵蛋白是廣泛存在于動物體內(nèi)的貯鐵蛋白，起貯存鐵的作用，腦內(nèi)鐵主要以鐵蛋白的形式存在，鐵蛋白在一定程度上反映體內(nèi)鐵水平。一方面，鐵代謝可以產(chǎn)生具有氧化毒性的自由基，而這些自由基可促進(jìn)合成某些胍類復(fù)合物，這些胍類復(fù)合物通過對神經(jīng)細(xì)胞的興奮作用而導(dǎo)致癲癇發(fā)作。血腦屏障在維持腦內(nèi)鐵代謝平衡的過程中發(fā)揮重要[16]，Michalak等[17]的實驗可檢測到KA誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作后血腦屏障的通透性增加，鐵參與多種生物膜的物質(zhì)合成和分解，當(dāng)鐵過量沉積時，可破壞膜的物質(zhì)合成，從而改變膜的穩(wěn)定，對于血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的穩(wěn)定產(chǎn)生威脅，破壞腦內(nèi)物質(zhì)平衡，從而誘發(fā)癲癇。

綜上所述，血清中的鐵含量可在一定程度上反映體內(nèi)鐵代謝水平，腦內(nèi)鐵主要以鐵蛋白的形式存在，鐵蛋白在一定程度上反映體內(nèi)鐵水平，該兩種檢測方法較為方便快捷，可為研究鐵與癲癇的關(guān)系及發(fā)病機(jī)制提供新見解，或許可以成為一個潛在的監(jiān)測癲癇的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠血中存在鐵和鐵蛋白含量的升高，推測癲癇大鼠存在鐵和鐵蛋白代謝的異常，血清鐵和鐵蛋白的增高與SD大鼠癲癇發(fā)作有關(guān)，而SD大鼠癲癇發(fā)作腦脊液及腦內(nèi)鐵含量的變化是否與血液鐵含量的變化具有相關(guān)性有待于進(jìn)一步探究[17]。