紫外誘變選育高產(chǎn)酒精及酸的釀酒酵母

王犁燁，陳新軍，盧丕超，劉維兵，高 飛，馬 珊，張 穎，武 運(yùn)*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 昌吉 832200；3.新疆維吾爾自治區(qū)科技項目服務(wù)中心，新疆 烏魯木齊 830011；4.吐魯番市質(zhì)量與計量檢測所，新疆 吐魯番 838000）

酵母菌是泛指能發(fā)酵糖類的各種單細(xì)胞真核微生物，主要分布在含糖質(zhì)較高的偏酸性環(huán)境[1]。酵母菌與人類關(guān)系密切，是人類實踐中應(yīng)用較早的一類微生物，被運(yùn)用于釀造、食品、醫(yī)藥等方面[2]。通常從自然界分離得到的野生菌株在發(fā)酵性能和功能上都具有一定的局限性，因此研究人員通過對已知菌株進(jìn)行誘變，從基因?qū)用嫔细淖兘湍妇男再|(zhì)及功能，從而達(dá)到生產(chǎn)需要[3-6]。

目前，常用的誘變方式包括物理方式和化學(xué)方式，紫外線誘變（ultraviolet mutagenesis，UV mutagenesis）是常見的物理誘變方式，廣泛用于微生物菌種的誘變處理，并且有著悠久的歷史[7-8]。紫外線能量低，對核酸造成的傷害比較單一，具有操作簡便、效率高、安全性好、誘變效率高等優(yōu)點，在避光條件下誘變結(jié)束后已產(chǎn)生突變的性狀不易恢復(fù)，因此應(yīng)用較廣泛[9-10]。

新疆地區(qū)生態(tài)環(huán)境獨特，區(qū)位優(yōu)勢明顯，是發(fā)展釀酒葡萄的理想產(chǎn)區(qū)[11]。但由于新疆夏季光照時間長，光照強(qiáng)度大，所以葡萄酸度低，對葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。試驗以從葡萄表面篩選的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株Y6為出發(fā)菌，通過紫外誘變對其發(fā)酵性能進(jìn)行改造，以期獲得高產(chǎn)酒精及酸且發(fā)酵性能穩(wěn)定的目標(biāo)釀酒酵母菌株，通過微生物代謝來增加葡萄酒的酒精度和酸度，以期提高新疆葡萄酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

出發(fā)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株Y6：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、無水乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司；溴甲酚綠：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基：0.05 g TTC，0.5 g葡萄糖，2 g瓊脂，100 mL蒸餾水，121℃滅菌15min。

TTC下層培養(yǎng)基：10 g/L葡萄糖，2 g/L蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，1 g/L KH2PO4，0.4 g/L MgSO4·7H2O，20 g/L瓊脂，1 000 mL蒸餾水，調(diào)pH值為5.5～5.7，121℃滅菌15 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：6 g/L馬鈴薯浸粉，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂，1 000 mL蒸餾水，調(diào)pH值為5.6～5.8，115℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，20 g/L瓊脂，1 000 mL蒸餾水，121℃滅菌15 min。

溴甲酚綠培養(yǎng)基：6 g/L馬鈴薯浸粉，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂，0.1 g/L溴甲酚綠，1 000 mL蒸餾水，調(diào)pH值為6.0，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HR40-A2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；MJX-160-Z霉菌培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1810紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20 PLUS pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PAL-1型手持糖度計：北京陽光億事達(dá)科技有限公司；Y15全自動分析儀：美國Biosystem公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的活化和菌懸液的制備

將菌株Y6接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)24 h；然后以2%的接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)24 h后，接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中；其次挑選出菌落大，表面光滑，呈乳白色的單菌落為出發(fā)菌，接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基斜面上，在冰箱中保存；最后將斜面上的出發(fā)菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，在28℃條件下培養(yǎng)24 h，重復(fù)兩次制得菌懸液。

1.3.2 Y6酵母生長曲線的測定

將在YPD液體培養(yǎng)基中活化好的菌株Y6菌懸液以5%的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)，每間隔2 h取一次樣，在波長600 nm處測定吸光度值，以空白培養(yǎng)基為對照，根據(jù)測得的吸光度值繪制菌株Y6的生長曲線，確定菌株Y6的生長對數(shù)期。

1.3.3 紫外誘變試驗

吸取4 mL處于對數(shù)生長期的菌懸液放入培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在距30 W的紫外燈30 cm處進(jìn)行照射，照射時間分別為40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，同時做空白對照組。照射結(jié)束后，分別將每個平板中的菌懸液稀釋1011倍并涂布在3個YPD固體培養(yǎng)基上，在28℃避光條件培養(yǎng)48 h，防止光復(fù)活，平板計數(shù)，計算致死率，并隨機(jī)選取誘變后的酵母菌斜面保藏，進(jìn)行發(fā)酵實驗[12]。致死率計算公式如下：

式中：Z為致死率，%；X1為紫外線處理后的菌落數(shù)，個；X對照

組的菌落數(shù)，個。

1.3.4 誘變菌株產(chǎn)酒精產(chǎn)酸能力初篩

（1）TTC培養(yǎng)基篩選[13-15]

采用劃線法將挑選出的突變菌株接種于TTC下層培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)48 h后，在TTC下層培養(yǎng)基上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，并于28℃條件下培養(yǎng)3 h，觀察培養(yǎng)平皿中的顯色情況，從中篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的突變菌株。

（2）溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選[16]

先在培養(yǎng)皿中倒入一層剛好可以覆蓋培養(yǎng)皿底部的溴甲酚綠培養(yǎng)基，待其凝固后放入牛津杯，再在牛津杯外圍倒入一層溴甲酚綠培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，將TTC培養(yǎng)基篩選出的顏色較深的酵母菌株進(jìn)行活化，吸取0.1 mL菌液環(huán)接種于牛津杯空洞內(nèi)，在28℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察黃色圈，選擇菌落周圍出現(xiàn)較大黃色圈的菌株進(jìn)行發(fā)酵能力試驗。

（3）菌株發(fā)酵能力測試[17]

將前兩步篩選出的突變酵母菌株，以5%的接種量分別接種于裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中后，放入杜氏小管，并確保杜氏小管內(nèi)無氣泡，在28℃的條件下培養(yǎng)，每12h觀察一次突變菌株產(chǎn)氣情況，記錄杜氏小管內(nèi)的填充度，了解誘變菌株的發(fā)酵性能。

1.3.5 誘變菌株產(chǎn)酒精產(chǎn)酸能力復(fù)篩

將葡萄汁于115℃滅菌20 min，分裝在5個三角瓶中，每瓶150 mL，測定葡萄汁的糖度為23.6°Bx，總酸為4.94 g/L。將上述篩選的誘變菌株和出發(fā)菌株同時以5%的接種量接種于葡萄汁中，在25℃條件下培養(yǎng)10 d，測定菌株產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸能力，確定目標(biāo)菌株。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性試驗[18]

將目標(biāo)菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，將每一代菌株以5%的接種量接種于糖度為23.6°Bx，總酸為4.94 g/L的葡萄汁中，在28℃條件下培養(yǎng)10 d，測定突變菌株的產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y 6的生長曲線

圖1 菌株Y6的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain Y6

微生物所處的生理狀態(tài)對誘變效果有很大影響，酵母菌處于對數(shù)生長期時，其個體之間的形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等基本一致，數(shù)目以穩(wěn)定的幾何指數(shù)增長且對環(huán)境因素的作用十分敏感[19-20]。在此階段進(jìn)行紫外輻照，可以增加基因突變、穩(wěn)定遺傳的幾率[21]。如圖1所示，菌株Y6在前4 h OD600nm值基本保持不變，此時菌株處于遲緩期；在4～16 h OD600nm值急速上升，菌株處于對數(shù)生長期，在16 h后酵母菌進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，選擇在10 h對菌株Y6進(jìn)行紫外誘變。

2.2 最佳紫外誘變時間的確定

圖2 不同輻照時間對菌株Y6致死率的影響Fig.2 Effect of different irradiation time on the lethality rate of strain Y6

由圖2可知，菌株Y6的致死率隨著紫外燈照射時間的延長而急速上升，這表明照射時間對酵母菌株的致死率有重要影響。紫外線具有較強(qiáng)的殺菌能力和誘變能力，較高的致死率有利于優(yōu)良菌株的篩選，但如果照射時間過長，會使得一些高活性菌株致死，不利于篩選。通常正向突變一般都出現(xiàn)在70%～80%致死率中[22]，因此試驗選擇的最佳輻照時間為100 s，此時菌株致死率為76.52%，較符合酵母菌正向突變的理想致死率。

2.3 誘變菌株產(chǎn)酒精產(chǎn)酸能力初篩

2.3.1 TTC培養(yǎng)基篩選結(jié)果

將紫外誘變100 s后的20株酵母菌株接種到TTC培養(yǎng)基上，顯色情況如表1所示。

表1 20株紫外誘變酵母菌株在TTC培養(yǎng)基的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of 20 yeast strains by ultraviolet mutation on the TTC media

TTC作為一種顯色劑，能對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)，并且通過反應(yīng)顏色的深淺來判斷酵母中呼吸酶活力大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低，通常情況下，產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)的酵母菌株在顯色培養(yǎng)基上顯現(xiàn)的顏色越深。采用劃線法誘變菌株接種到TTC培養(yǎng)基上，結(jié)果如表1所示。由表1可知，菌株Y6-5、Y6-6、Y6-13、Y6-14、Y6-15、Y6-17、Y6-20顯色最為明顯，為深紅色，比出發(fā)菌株Y6的顏色更深，這說明酵母菌株經(jīng)過紫外照射后，產(chǎn)酒精能力確實增強(qiáng)了。因此，將篩選出的菌株Y6-5、Y6-6、Y6-13、Y6-14、Y6-15、Y6-17、Y6-20進(jìn)行溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選試驗。

2.3.2 溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選結(jié)果

將菌液注入牛津杯孔洞中，在溴甲酚綠培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖3所示。

圖3 7株突變菌株在溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of 7 mutant strains on the bromocresol green media

由圖3可知，菌株Y6-6、Y6-15、Y6-20牛津杯周圍的黃色圈明顯小于菌株Y6，這說明菌株Y6-6、Y6-15、Y6-20這三株菌的產(chǎn)酸能力不如出發(fā)菌株Y6，而菌株Y6-5、Y6-13、Y6-14這三株菌牛津杯周圍的黃色圈明顯大于菌株Y6，表明這三株菌的產(chǎn)酸能力明顯大于菌株Y6。菌株Y6-17牛津杯周圍的黃色圈和菌株Y6大致相同，因此也做備選。將挑選菌株Y6-5、Y6-13、Y6-14、Y6-17菌株進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵試驗。

2.3.3 菌種發(fā)酵能力測試結(jié)果

將杜氏小管排氣倒置放入接有菌株Y6-5、Y6-13、Y6-14、Y6-17的試管中，產(chǎn)氣結(jié)果如表2所示。

由表2可知，當(dāng)培養(yǎng)12 h時，菌株Y6-5、Y6-13、Y6-14產(chǎn)氣速度較快，CO2氣體充滿1/3杜氏小管；當(dāng)培養(yǎng)24 h時，菌株Y6-13、Y6-14產(chǎn)生的CO2充滿50%杜氏小管，而菌株Y6-5已經(jīng)將杜氏小管充滿；當(dāng)培養(yǎng)36 h時，菌株Y6-5、Y6-13已經(jīng)充滿整個杜氏小管且在培養(yǎng)48 h時，接有菌株Y6-5試管中的杜氏小管離開底部漂浮在試管中，而菌株Y6-14、Y6-17仍不能充滿整個小管，但四支試管底部均存在大量菌體沉淀，說明這四株誘變酵母的起酵能力為菌株Y6-5＞菌株Y6-13＞菌株Y6-14＞菌株Y6-17。

表2 4株突變酵母菌株杜氏小管試驗結(jié)果Table 2 Results of Duchenne tubule tests for 4 mutant strains

2.4 誘變菌株復(fù)篩結(jié)果

將5株菌株分別接種到葡萄汁后，其產(chǎn)酒精及產(chǎn)酸情況如表3所示。

表3 4株突變酵母菌株與出發(fā)菌株Y6產(chǎn)酒精及產(chǎn)酸情況Table 3 Production of alcohol and acid by 4 mutant yeast strains and original strain Y 6

由表3可知，與出發(fā)菌株Y6相比，誘變菌株的產(chǎn)酸產(chǎn)酒精能力明顯增強(qiáng)，與初篩結(jié)果一致。4株誘變菌株產(chǎn)酒精能力依次為菌株Y6-5＞菌株Y6-17＞菌株Y6-14＞菌株Y6-13；4株誘變菌株的產(chǎn)酸情況也存在差別，其能力強(qiáng)弱依次為：菌株Y6-5＞菌株Y6-17＞菌株Y6-14＞菌株Y6-13，但菌株產(chǎn)主要有機(jī)酸種類基本一致，為L-乳酸、酒石酸以及蘋果酸。由此可以猜測菌株經(jīng)過紫外照射后，雖然改變了菌株產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱，但產(chǎn)主要有機(jī)酸種類不會發(fā)生改變。在國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》中限定葡萄酒中揮發(fā)酸≤1.2 g/L，以上菌株均符合要求。因此，將菌株Y6-5確定為目標(biāo)菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

將突變菌株Y6-5培養(yǎng)5代，把每一代菌液接種到葡萄汁中發(fā)酵10 d，發(fā)酵液的酒精度和總酸分析結(jié)果見圖4。

由圖4可知，第四代菌株產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)為12.33%vol，第二代菌株產(chǎn)酸能力最強(qiáng)為2.15 g/L。雖然5代菌株的產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力存在差距，但產(chǎn)酸能力都維持在2.1 g/L左右且揮發(fā)酸含量在0.35 g/L左右，產(chǎn)酒精能力都維持在12%vol左右。結(jié)果表明，突變菌株Y6-5的高產(chǎn)酸和酒精性能可以穩(wěn)定地遺傳。

圖4 突變菌株Y6-5產(chǎn)酒精（A）及產(chǎn)酸（B）能力遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.4 Genetic stability tests results of mutant strain Y 6-5 with the capacity of producing alcohol(A)and producing acid(B)

3 結(jié)論

本研究以在葡萄表面篩選出的釀酒酵母菌株Y6為出發(fā)菌，在確定了照射功率為30 W和照射距離為30 cm的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗確定最佳照射時間為100 s。利用TTC培養(yǎng)基試驗、溴甲酚綠培養(yǎng)基試驗以及杜氏小管試驗將照射后挑選的20株突變菌株進(jìn)行篩選，最后再經(jīng)葡萄汁發(fā)酵試驗獲得一株突變菌株Y6-5，其產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酒精能力都明顯高于出發(fā)菌株的Y6。將突變菌株Y6-5培養(yǎng)5代，分別接種到葡萄汁中待發(fā)酵結(jié)束后，該突變菌株產(chǎn)酸2.1 g/L，產(chǎn)酒精12.3%vol，較出發(fā)菌株Y6分別提高了201.41%和28.13%，并且遺傳性能穩(wěn)定，可以用來提高新疆葡萄酒品質(zhì)。