Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選地芍苣冬顆粒提取工藝△

李玉婷，張剛，姜林，*，郝夢(mèng)，依孜提·帕力哈提，劉怡，張麗娟，張良，唐梅

1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000

隨著生活條件的提高，高血壓已經(jīng)成為一種越來越普遍的癥狀。相關(guān)研究[1]表明，18歲以上的高血壓患病率約為10.34%，其中男性所占的比例是8.61%，女性所占比例是11.75%。高血壓病是最常見的心血管疾病之一[2]，常有心、腦、腎等臟器的并發(fā)癥引起的重要器官的病變，在很大程度上影響著患者的身體健康。地芍苣冬湯是根據(jù)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院多年中醫(yī)周銘心專家臨床治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)，以及高血壓的發(fā)病機(jī)理和治療原則總結(jié)而成的經(jīng)驗(yàn)方。本方不僅對(duì)輕中度高血壓病有較好的血壓控制療效，還能明顯改善高血壓患者頭暈、頭痛、心悸、煩躁、失眠癥狀，并對(duì)腰膝酸軟、口干、耳鳴、健忘、手足心熱等癥狀亦能減輕。

此方傳統(tǒng)劑型為湯劑，將其開發(fā)成顆粒劑則可以克服湯劑服用劑量大、口感差、儲(chǔ)存攜帶不便等不足，且能使其質(zhì)量穩(wěn)定。[2]本方由生地、白芍、天麻、龍骨等9味藥組成。白芍為方中臣藥，有止痛平肝、柔肝補(bǔ)血、收汗斂陰、平抑肝陽等功能。彭珍香等[3]研究證明，芍藥苷呈內(nèi)皮依賴性舒張血管平滑肌，機(jī)制可能與其促進(jìn)NO的合成釋放有關(guān)。天麻為方中佐藥，有息風(fēng)止痙、平抑肝陽和祛風(fēng)通絡(luò)的功能，對(duì)于高血壓、偏頭痛和失眠等有較好的治療效果。謝世虎[4]研究證明，天麻素與腎上腺素能產(chǎn)生拮抗作用，且能調(diào)節(jié)血管的收縮作用，使人體的微小血管擴(kuò)張，進(jìn)一步控制血壓。臨床經(jīng)驗(yàn)表明，天麻在高血壓的治療中，具有非常好的效果，對(duì)于患者的冠狀動(dòng)脈血流量有極明顯的調(diào)節(jié)作用。故選擇芍藥苷及天麻素為化學(xué)指標(biāo)[5]，優(yōu)化本方提取工藝。此外，通過離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)得出的離體血管舒張率，將其作為藥效學(xué)指標(biāo)，結(jié)合化學(xué)成分指標(biāo)，最終確定本方的提取工藝。本實(shí)驗(yàn)以綜合評(píng)分(天麻素含量、芍藥苷含量、離體血管舒張率)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝，為該制劑的工業(yè)化大生產(chǎn)提供方案。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1525型高效液相色譜儀(含2489型PAD檢測(cè)器、Empower Pro工作站，美國(guó)Waters公司)；Centra-20型紫外-可見分光光度計(jì)(GBC科學(xué)儀器有限公司)；BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、離體組織灌流裝置(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；AG-135型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試藥

天麻素對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為807-200104、110736-201337)；乙腈色譜純；其他試劑均為分析純。

藥材飲片均購自新疆玖元堂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下的要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻素、芍藥苷含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 SymmetryShieldTMRP18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5m)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫(0～11 min，2%A；11～12 min，2%～14%A)；流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；天麻素檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm[6]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取一定量的天麻素及芍藥苷對(duì)照品，分別制成質(zhì)量濃度為0.25、1.82 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的配制 稱取適量的處方藥材，加水10倍量，浸泡1 h，加熱回流提取1 h，提取2次。量取其上清液5 mL濃縮蒸干，干膏加少量的色譜甲醇溶解，定容到5 mL容量瓶中，經(jīng)0.45m的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的配制 按處方量分別稱取缺少天麻和白芍的藥材，按2.1.3方法制備陰性供試品溶液。結(jié)果見圖1。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制質(zhì)量濃度為0.25 mg·mL-1的天麻素對(duì)照品溶液，分別取1、2、3、4、5 mL用甲醇定容到5 mL容量瓶中，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·mL-1的天麻素對(duì)照品系列溶液，如2.1.1項(xiàng)下色譜條件下完成測(cè)定，以天麻素濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，得天麻素線性回歸方程：Y=21 059 052X-13 275.4(r=0.999 2)，線性范圍0.05～0.25 mg·mL-1。

配制質(zhì)量濃度為1.82 mg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液，分別取1、2、3、4、5 mL用色譜甲醇定容于5 mL容量瓶中，稀釋成為5個(gè)濃度梯度的芍藥苷對(duì)照品系列溶液，如2.1.1項(xiàng)下色譜條件完成測(cè)定，以芍藥苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得芍藥苷線性回歸方程：Y=5 906 097.353X(r=0.999 2)，線性范圍0.364～1.82 mg·mL-1。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密量取10 μL的混合對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算天麻素、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.16%、1.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方精密稱取6份藥材，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，如2.1.1項(xiàng)下色譜條件完成測(cè)定，計(jì)算天麻素、芍藥苷峰面積的RSD分別為2.24%、0.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

注：A.對(duì)照品(220 nm)；B.對(duì)照品(230 nm)；C.樣品(220 nm)；D.樣品(230 nm)；E.陰性樣品(220 nm)；F.陰性樣品(230 nm)；1.天麻素；2.芍藥苷。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣10 μL，計(jì)算天麻素、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.40%、2.09%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收試驗(yàn) 取2.1.7項(xiàng)下已知含量的供試品溶液6份，分別加入天麻素、芍藥苷對(duì)照品0.78、6.37 mg，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件完成測(cè)定，其平均回收率為99.11%、98.48%，RSD分別為2.20%、1.90%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，本品有良好的回收率。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取次數(shù)的考察 將加水倍量固定為10倍，浸泡時(shí)間固定為1 h，提取時(shí)間固定為2 h，分別考察提取1、2、3次的含量，結(jié)果各組分含量在1～3次呈增加趨勢(shì)，但各組分含量2次與3次相差不大，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況選取2次作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取次數(shù)。

2.2.2 提取時(shí)間的考察 將提取次數(shù)固定為2次，加水量固定為10倍，分別按0.5、1、1.5、2 h進(jìn)行提取，結(jié)果各組分含量在0.5～1 h呈增加趨勢(shì)，在1～2 h呈遞減趨勢(shì)，故1 h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 浸泡時(shí)間的考察 將提取次數(shù)固定為2次，加水量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1 h，分別提取浸泡時(shí)間為0.5、1、1.5、2 h的供試品測(cè)定含量，結(jié)果各組分含量在0.5～1.5 h呈增加趨勢(shì)，在1.5～2 h呈遞減趨勢(shì)，故1.5 h為最佳浸泡時(shí)間。

2.2.4 加水倍數(shù)的考察 將提取次數(shù)固定為2次，提取時(shí)間固定為1 h，分別提取加水倍數(shù)為6、8、10、12倍的供試品，結(jié)果各組分含量在8～10倍呈增加趨勢(shì)，在10～12倍呈遞減趨勢(shì)，故加10倍量水為最佳加水倍數(shù)。

2.3 體外血管環(huán)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 大鼠主動(dòng)脈環(huán)的獲取 本次實(shí)驗(yàn)用頸椎脫臼法處死大鼠，用鼠板固定后從腹部起直至胸腔剪開，配置0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，調(diào)節(jié)其pH為7.2，用棉花蘸取此緩沖液輕輕地擦拭組織表面以使視野清晰。找到胸主動(dòng)脈的兩端用止血鉗鉗夾后剪斷，快速取出胸主動(dòng)脈放入盛有已充入混合氣體(95%O2+5%CO2)的4 ℃ kerb’s液培養(yǎng)皿中[用蒸餾水配成10倍的母液(mmol·L-1)：NaCl 118、KCl 4.7、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO320、KH2PO41.1、葡萄糖4.5、CaCl21.25]，葡萄糖需要在臨用前加入，且需調(diào)節(jié)其溶液pH在8.1～8.4，將血管在4 ℃的kerb’s液中不斷漂洗以去除血管內(nèi)殘余血液，并剪去殘余的脂肪組織和結(jié)締組織。將胸主動(dòng)脈剪成大約3 mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)放置于已經(jīng)通入混合氣體的4 ℃ kerb’s液中，備用[7]。

2.3.2 血管環(huán)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，血管環(huán)下端固定，上端通過張力換能器連于自動(dòng)平衡記錄儀，持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體，調(diào)節(jié)血管環(huán)預(yù)負(fù)荷為1 g。平衡90 min后開始給藥。在氯化鉀(kcl，40 mmol·L-1)預(yù)致血管收縮的條件下，觀察不同提取方法的藥物對(duì)體外血管張力的影響[8]，結(jié)果用離體血管舒張率表示。

(1)

2.4 提取工藝優(yōu)選

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為2次，選擇提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)作為影響因素，以天麻素含量、芍藥苷含量、離體血管舒張率為評(píng)價(jià)指標(biāo)(根據(jù)本方中各化學(xué)指標(biāo)對(duì)本方藥效貢獻(xiàn)程度的大小綜合考慮，決定其權(quán)重系數(shù)分別為25%、35%、40%)，采用Design-Expert 8.0.4 Trial軟件試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 模型的擬合 采用ANOVA對(duì)各因素進(jìn)行多元二次回歸，得回歸方程：

Y=91.41+0.87A+7.68B+9.40C-4.75AB+8.37AC-6.83BC-19.13A2-12.16B2-18.37C2

從表2的方差分析表可以看出，B、C、A2、B2、C2具有顯著性影響，影響程度為C>B>A；失擬項(xiàng)為0.328 0>0.05，表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)系數(shù)r為0.968 7，證明該模型擬合很好，可用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)回歸分析結(jié)果，得其三維曲面圖，結(jié)果如圖2。

注：A.浸泡時(shí)間和加水倍量對(duì)綜合評(píng)分的影響；B.提取時(shí)間和加水倍量對(duì)綜合評(píng)分的影響；C.提取時(shí)間和浸泡時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響。

表2 方差分析

注：“—”為無意義的值。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析，最佳提取工藝：浸泡時(shí)間1.62 h，加10.08倍量水，提取時(shí)間1.11 h；結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)確定最佳工藝為浸泡1.5 h，加10倍量水提取2次，每次1 h。按優(yōu)選的提取工藝再進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果天麻素、芍藥苷平均質(zhì)量濃度分別為0.59、6.35 mg·g-1；平均離體血管舒張率為71.03%。綜合評(píng)分和預(yù)測(cè)值的偏差較小，表明該二項(xiàng)式模型擬合效果良好，可信度高。結(jié)果如表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

地芍苣冬湯中生地為其君藥，其主要成分為梓醇及毛蕊花糖苷，未將其兩種成分作為含量測(cè)定指標(biāo)的原因如下：1)處方中毛蕊花糖苷的理論含量小于制劑的萬分之一，含量測(cè)定指標(biāo)應(yīng)體現(xiàn)對(duì)制劑質(zhì)量的可控性，含量低于萬分之二已基本沒有質(zhì)控意義，故未將毛蕊花糖苷作為含測(cè)指標(biāo)。處方中梓醇的理論含量為制劑的萬分之三，含量也相對(duì)偏低；2)梓醇為環(huán)烯醚萜類化合物，經(jīng)查閱文獻(xiàn)知其對(duì)熱和酸不穩(wěn)定，在酸性條件下可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。故猜測(cè)其與方中其他藥材發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，故未能測(cè)出；3)查閱文獻(xiàn)得知，生地中含有梓醇及能水解梓醇的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶易被高溫破壞，在低溫下活性較強(qiáng)。故影響梓醇穩(wěn)定性的3個(gè)主要因素歸結(jié)為β-葡萄糖苷酶酶解、酸堿度和溫度。所以提取梓醇的過程中，考察了β-葡萄糖苷酶抑制劑加入量、pH值及溫度對(duì)其含量的影響，但是經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索，并未測(cè)出梓醇。故采用了臣藥白芍中芍藥苷及佐藥天麻中天麻素作為含量測(cè)定指標(biāo)。

離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)中，在配置離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)中所需的kerb’s營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，最后加入Cacl2時(shí)多次出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，考慮到是加入時(shí)未快速攪拌以避免形成絡(luò)合物，改良操作方法后配置出了澄清的營(yíng)養(yǎng)液。且血管環(huán)需放置在4 ℃ kerb’s營(yíng)養(yǎng)液中以保證血管的存活時(shí)間。

本方為治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)方，以君藥和臣藥中主要化學(xué)成分為指標(biāo)；通過離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)確定了本方有擴(kuò)張血管作用，故將離體血管舒張率作為藥效學(xué)指標(biāo)以優(yōu)化提取工藝。其擴(kuò)張血管作用也為本方降壓機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。將化學(xué)成分指標(biāo)與藥效學(xué)指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步優(yōu)化了本方的提取方法，使優(yōu)選出的工藝更準(zhǔn)確可靠，這是本文的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，同時(shí)也為中藥復(fù)方提取工藝的優(yōu)化提供了新思路。