不同品種苜蓿對低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性評價

王明瑩

(呼倫貝爾學(xué)院 內(nèi)蒙古 海拉爾 021008)

苜蓿(Medicago)是多年生豆科牧草， 苜蓿種類繁多， 適口性佳， 是優(yōu)良的牧草。[1]在高緯度寒冷地區(qū)， 低溫使得苜蓿不能正常越冬， 從而降低了苜蓿的產(chǎn)量。 國內(nèi)外學(xué)者在低溫對苜蓿影響的研究中發(fā)現(xiàn)， 抗寒能力不同的植物電導(dǎo)率有較明顯的差異。 郝培彤研究發(fā)現(xiàn)， 苜蓿越冬期由于根莖積累越冬保護(hù)性糖表現(xiàn)出較強的越冬能力， 低溫時會合成大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高保護(hù)酶的活力， 進(jìn)而提高植物的抗寒能力；[2]馬維文研究越冬期白三葉的生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)， 脯氨酸、 過氧化物酶、 可溶性糖隨溫度降低而增加， 丙二醛含量會隨溫度降低先下降后增加；[3]朱愛民研究發(fā)現(xiàn)， 苜蓿根系低溫脅迫時抗氧化酶活性增加；[4]徐洪雨等研究發(fā)現(xiàn)， 苜蓿低溫時植物細(xì)胞膜透性加大。[5]

目前，有關(guān)呼倫貝爾地區(qū)引種不同品種苜蓿比較抗寒性的研究較少，本試驗有助于豐富高寒地區(qū)苜蓿資源生產(chǎn)、加速苜蓿新品種選育、推動地區(qū)牧草抗寒性研究。通過在呼倫貝爾地區(qū)引進(jìn)的苜蓿進(jìn)行田間栽培，對9種不同品種苜蓿進(jìn)行低溫脅迫，選取抗寒性指標(biāo)進(jìn)行測定與分析，從生理生化角度篩選出適合該地區(qū)種植、抗寒能力較強的苜蓿品種，這對苜蓿引種栽培具有理論指導(dǎo)和實踐意義。

1 研究地概況

試驗地區(qū)位于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗牧草種植基地，地處呼倫貝爾南部，北緯48°27′-48°35′，東經(jīng)119°35′-119°41′。海拔高度760-770 m。年平均溫度-2.4℃。年平均降水量320-400 mm，主要集中在6-8月，占全年降水量的70%以上。年蒸發(fā)量1478.8mm，年積溫1952.6℃，無霜期113 d左右。試驗地土壤為沙質(zhì)鹽化草甸土。試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。小區(qū)試驗田面積10 m2，苜蓿行距30 cm。

2 研究方法

2.1 苜蓿采集及冷處理

鄂溫克族自治旗牧草種植基地采集供試的9種苜蓿，選取生長良好的各品種植株，置于4℃(低溫脅迫處理)的人工氣候箱中處理7天，所有處理設(shè)置3個重復(fù)，之后取出并采集葉部進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，低溫處理前(25℃)作為對照組。測定游離脯氨酸含量(PRO)、丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、葉綠素相對含量、相對電導(dǎo)率，共六項指標(biāo)。

表1 供試苜蓿品種

2.2 各指標(biāo)的測定方法[6]

PRO含量的測定采用酸性茚三酮法；MDA含量的測定硫代巴比妥酸法測定；SOD活性的測定采用比色法；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法；相對電導(dǎo)率的測定采用電導(dǎo)率儀測定法；葉綠素含量的測定使用葉綠素含量測定儀。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行圖表繪制，用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行不同品種間各指標(biāo)的比較。

抗寒性綜合評價：采用隸屬函數(shù)法[7]綜合分析。各指標(biāo)隸屬函數(shù)計算公式：

X1=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X2=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中X1和X2為測定各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，X為各材料的指標(biāo)測定值Xmin為各材料中測定指標(biāo)的最小值，Xmax為各材料中測定指標(biāo)的最大值。其中，PRO、SOD、POD、葉綠素含量等指標(biāo)用公式(1)計算；相對電導(dǎo)率、MDA與耐寒性呈負(fù)相關(guān)，用公式(2)計算。將各指標(biāo)求平均值，平均值越大表示耐寒性越強。

3 結(jié)果分析

3.1 不同品種苜蓿PRO含量變化

由圖1中可知，9種苜蓿的PRO含量各不相同，在低溫處理前PRO含量最大的是馴鹿苜蓿，低溫處理后9種苜蓿的PRO含量都大幅度增加，其中新苜和阿爾岡金PRO含量變化較大。馴鹿PRO 含量增加了46.15%，低溫處理后龍苜806的PRO 含量最少，顯著低于新苜、阿爾岡金、俄羅斯雜花苜蓿和東苜2號(p<0.05)。與對照組比較，低溫處理后9種苜蓿PRO含量增加的幅度由大到小依次為新苜>阿爾岡金>東苜5號>BL205>龍苜806>俄羅斯雜花苜蓿>草原2號>黃花苜蓿>馴鹿。

圖1 不同品種苜蓿游離脯氨酸變化結(jié)果

3.2 不同品種苜蓿MDA含量變化

MDA含量越低表明苜蓿的細(xì)胞膜受傷程度較輕，由圖2中可知，低溫處理后MDA都有不同程度的增加，9種苜蓿低溫處理前的MDA含量最高的是東苜2號，阿爾岡金和BL202的MDA含量最低，阿爾岡金和BL202與草原二號、馴鹿、東苜2號和黃花苜蓿存在顯著差異(p<0.05)。低溫處理后，MDA含量最高的是東苜2號，最少的是黃花苜蓿；與對照組比較，低溫處理后MDA含量增加最多的是BL202(增加了176.9%)，處理前后MDA含量變化幅度較小的是馴鹿(增加了51.58%)和俄羅斯雜花苜蓿(增加了51.04%)。與對照組比較，9種苜蓿低溫處理后MDA含量變化幅度由大到小依次是BL202>黃花苜蓿>東苜2號>草原二號>龍苜806>阿爾岡金>新苜>俄羅斯雜花苜蓿>馴鹿。

圖2 不同品種苜蓿MDA含量變化結(jié)果

3.3 不同品種苜蓿SOD活性變化

當(dāng)植物受到低溫脅迫時，植物可以通過升高SOD活性增強對低溫的適應(yīng)能力。從圖3中可以看出，9種苜蓿抗寒處理前SOD活性新苜與草原二號、東苜2號和龍牧806之間存在顯著差異(p<0.05)。東苜2號和草原二號與新苜和BL202之間的差異顯著(p<0.05)。低溫處理后，草原二號、東苜2號、龍苜806、黃花苜蓿的SOD活力均升高。其中，草原二號升高幅度最大達(dá)到27.6%，SOD活性為231U/gFW，草原二號和龍苜806的SOD活性顯著高于其它品種苜蓿(p<0.05)。低溫處理后，SOD活力由強到弱依次是草原二號>龍苜806>新苜>黃花苜蓿>BL202>東苜2號>阿爾岡金>俄羅斯黃花苜蓿>馴鹿。

圖3 不同品種苜蓿SOD含量變化結(jié)果

3.4 不同品種苜蓿POD活性變化

POD能分解過氧化物，可以避免植物細(xì)胞受傷害。從圖4中可以看出，低溫處理后新苜、草原二號、阿爾岡金、BL202的POD活性降低。與對照組比較，新苜POD活性降低的幅度最大(45.53%)，俄羅斯雜花苜蓿、馴鹿、東苜2號、龍苜806、黃花苜蓿的POD活力大幅度增加。其中，東苜2號POD活性增加了347%，黃花苜蓿增加了80.5%。低溫處理后，東苜2號和黃花苜蓿的POD活力與其它品種苜蓿有顯著差異(p>0.05)，苜蓿通過POD活性的升高保護(hù)低溫對植物產(chǎn)生過氧化傷害。

圖4 不同品種苜蓿POD含量變化結(jié)果

3.5 不同品種苜蓿葉綠素相對含量變化

低溫可以影響植物葉綠素的合成與分解，從圖5中可以看出，低溫處理前葉綠素含量最高的是草原二號，最低的是新苜。處理后葉綠素相對含量均降低，與對照組相比，低溫處理后馴鹿葉綠素相對含量降低了71.43%，其次是東苜2號31.38%?？梢姷蜏靥幚砗笕~綠素的分解大于合成。低溫處理前后比較，9種苜蓿葉綠素相對含量變化率由大到小依次是馴鹿>東苜2號>草原二號>黃花苜蓿>俄羅斯雜花苜蓿>BL202>阿爾岡金>新苜>龍苜806。

圖5 不同品種苜蓿葉綠素相對含量變化結(jié)果

3.6 不同品種苜蓿相對電導(dǎo)率變化

植物細(xì)胞膜受傷會導(dǎo)致電導(dǎo)率值增加。從圖6中可以看出，低溫處理后不同品種苜蓿相對電導(dǎo)率均表現(xiàn)不同幅度的增加，說明低溫處理使細(xì)胞膜受到了不同程度的破壞，膜透性增加。新苜、草原二號、東苜2號、阿爾岡金、龍苜806和黃花苜蓿相對電導(dǎo)率與低溫處理前有顯著性差異。與處理前比較，9種苜蓿相對電導(dǎo)率上升的幅度依次為東苜2號>黃花苜蓿>馴鹿>草原二號>阿爾岡金>俄羅斯雜花苜蓿>新苜>BL202>龍苜806。

圖6 不同品種苜蓿相對電導(dǎo)率變化結(jié)果

3.7 不同品種苜蓿抗寒性綜合評價

用隸屬函數(shù)法計算低溫脅迫后各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，并對9種苜蓿各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值求其平均值，進(jìn)行排序。見表2，綜合評價9種苜蓿抗寒性的強弱。在低溫脅迫下，抗寒性由強到弱依次為：黃花苜蓿>草原二號>俄羅斯雜花苜蓿>龍苜806>阿爾岡金>東苜2號>馴鹿> BL202>新苜。

表2 9種苜蓿各指標(biāo)隸屬函數(shù)值比較

4 討論

4.1 游離脯氨酸(PRO)含量

PRO是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，低溫下其含量增加能夠加強其抗寒能力，抗逆性增加。在低溫條件下，PRO的親水性能穩(wěn)定細(xì)胞的代謝作用，研究結(jié)果表明低溫脅迫下，9種苜蓿葉片中PRO的含量都明顯增加，這一結(jié)果與羅新義[8]的研究相一致。

4.2 丙二醛(MDA)含量

低溫脅迫下，植物產(chǎn)生活性氧自由基的積累會破壞生物膜脂，引起膜脂的功能變化，影響了生物膜的通透性，進(jìn)而產(chǎn)生乙烯類的生理生化變化，生成過氧化產(chǎn)物丙二醛。通過丙二醛含量的高低來反映環(huán)境對植物帶來的影響，丙二醛含量越低植物就越能適應(yīng)逆境。[9]低溫脅迫后，9種苜?？购芰Σ畹钠贩N丙二醛含量變化幅度大。

4.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性

SOD是一種重要的抗氧化酶，它能夠清除植物代謝產(chǎn)生的自由基，可以阻斷氧自由基對細(xì)胞帶來的傷害，增加植物抗逆性。[10]為了更好地適應(yīng)低溫環(huán)境，保證安全度過逆境，植物體內(nèi)的SOD含量會增多。研究表明，低溫時SOD活性的增加會明顯增強植物的抗寒能力，各品種的抗寒性強弱與植物體內(nèi)SOD活性呈正相關(guān)，當(dāng)超過其耐寒力時，SOD活性則顯著下降，而且其下降的程度均可反映出苜蓿各品種耐寒力的大小。[11]因此，由圖3可以判斷草原二號處理前后增加最多，抗寒性強，馴鹿苜蓿降低最多，抗寒性弱。

4.4 過氧化物酶(POD)活性

POD能還原過氧化氫，從而降低了過氧化氫對植物細(xì)胞的傷害，有利于植物水分代謝和呼吸代謝，POD活性越大，其抗寒性就越強。[12][13]為了更好地適應(yīng)低溫環(huán)境，保證安全度過逆境，植物體內(nèi)的POD活性會增多。因此，由圖4可以判斷，POD活性處理后較處理前升高最多的是東苜2號。因此，東苜2號苜蓿在POD活性這一指標(biāo)中表現(xiàn)抗低溫傷害的能力最強，而輕度低溫處理后9種苜蓿POD活性有的降低有的升高，可能是不同品種之間低溫保護(hù)能力差異導(dǎo)致。

4.5 葉綠素相對含量

植物葉綠素能夠吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞光能，是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，可以反映植物營養(yǎng)物質(zhì)的情況。植物葉片色素含量減少，光合效率降低。植物受到低溫脅迫后，光合作用隨之下降，同時光合色素含量降低。由圖5可見，不同品種苜蓿低溫處理前和處理后相比較，葉綠素相對含量發(fā)生不同程度的下降，馴鹿苜蓿的葉綠素含量下降最多，可見低溫脅迫對其影響較大，低溫下葉綠素合成速度小于分解速度，這與李麗菁[14]對日本結(jié)縷草的葉綠素在低溫代謝變化的研究一致。

4.6 相對電導(dǎo)率

低溫條件下，植物的細(xì)胞膜被破壞，膜透性增大，從而葉片電導(dǎo)率的變化可以反映出細(xì)胞膜功能的變化，可用于衡量植物抗寒能力的強弱。低溫條件下對9種苜蓿進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率都有不同程度的增大。從圖6可以看出，處理前后相比，黃花苜蓿的相對電導(dǎo)率變化最大。草原二號的變化最小，抗寒能力大，這與王曉俊[15]的研究相一致，低溫對電導(dǎo)率的影響較大。

5 結(jié)論

本次試驗共選擇了9種苜蓿品種，測試其六項指標(biāo)。對9種苜蓿品種的抗寒性鑒定時，不同的指標(biāo)對結(jié)果的判定不同。由本文測定的幾個抗寒性指標(biāo)來看，低溫脅迫使不同品種苜蓿的游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、丙二醛、相對電導(dǎo)率等指標(biāo)增加，而葉綠素相對含量與對照比較有不同程度的下降。綜合多項指標(biāo)評價得出黃花苜蓿、草原二號、俄羅斯雜花苜蓿、龍苜806抗寒能力較強。其中，黃花苜?？购芰γ黠@優(yōu)于其它品種。