布魯菌病的實驗診斷方法及布魯菌的分子生物學(xué)分型方法研究進(jìn)展

于美美，管程程，張?zhí)?，李?/p>

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053)

布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生革蘭陰性小球桿菌，無鞭毛，無芽胞，光滑型菌株有微莢膜，現(xiàn)已被美國疾病預(yù)防控制中心列為B類病原體[1]。布魯菌感染家畜后可隨病畜的分泌物、排泄物、流產(chǎn)物及乳汁等排出至環(huán)境中，經(jīng)皮膚、黏膜、眼結(jié)膜、消化道、呼吸道等不同途徑感染人體。布魯菌感染可引起布魯菌病(簡稱布病)，在全球范圍內(nèi)造成較大經(jīng)濟(jì)損失和健康威脅[2]。布魯菌感染牛、羊、豬等動物，可引起動物流產(chǎn)等；通過直接傳播傳染人類，引起波浪熱、乏力、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、睪丸腫痛等。目前，我國布病的流行地域不斷發(fā)生變化，給畜牧產(chǎn)業(yè)及公共衛(wèi)生安全帶來的經(jīng)濟(jì)損失越來越大。對布病進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的實驗診斷和布魯菌分型對于布病的防控和治療具有重要的意義。現(xiàn)將布病的實驗診斷方法及布魯菌的分子生物學(xué)分型方法研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 布病的實驗診斷方法

布病的臨床癥狀復(fù)雜多變，生物安全等級較高，實驗室安全級別要求較高，一般醫(yī)院的臨床實驗室診斷方法有限，診斷準(zhǔn)確度欠佳，因此急需提高診斷方法的特異度和靈敏度。目前，布病的實驗診斷方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)方法等。

1.1 細(xì)菌培養(yǎng) 傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)是布魯菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本主要取自人和動物的血液、關(guān)節(jié)腔液、滑囊液、骨髓、腦脊液、流產(chǎn)胎、乳汁、胎盤等，若標(biāo)本取自菌血癥時期，則檢出率將大幅提升。但在實際臨床應(yīng)用中，細(xì)菌培養(yǎng)不是最常用的方法，胞內(nèi)寄生、標(biāo)本差異、病程、操作不當(dāng)及使用抗生素等均可影響培養(yǎng)結(jié)果，且細(xì)菌營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)耗時長，實驗室安全級別要求高[4]。Mangalgi等[5]比較了新的培養(yǎng)方法裂解/濃縮法(LC)、血凝塊培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，表明LC和血凝塊培養(yǎng)法要優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)。

1.2 免疫學(xué)診斷 免疫學(xué)診斷周期短，靈敏度高，對實驗室要求不高，更具臨床應(yīng)用價值。布病的免疫學(xué)診斷方法有試管凝集試驗(SAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、抗人球蛋白試驗(CT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、Brucellacapt(免疫捕獲凝集技術(shù))、補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)、免疫膠體金技術(shù)(ICG)、熒光偏振試驗(FPA)等。

1.2.1 SAT SAT是我國診斷布病的法定方法，其特異度好，但試驗時間長，操作復(fù)雜，不適合現(xiàn)場檢測和基層采用，慢性患者也可因抗體濃度低而漏診。Sanodze等[6]對141例布病患者及其家屬、近鄰進(jìn)行了分析，25例布魯菌血培養(yǎng)陽性者中只有23例呈SAT陽性，另2例均為患者家屬，說明SAT在早期檢測中靈敏度不足。

1.2.2 RBPT RBPT利用虎紅染色的抗原檢測血清中IgG類抗體，常和SAT聯(lián)合應(yīng)用于臨床，其靈敏度高，操作簡單，成本低，反應(yīng)時間短，適于布病的大規(guī)模初篩。Yohannes等[7]對241例布魯菌暴露者的血清進(jìn)行RBPT和SAT的檢測比較，顯示兩者吻合度較好。但RBPT缺乏抗原的標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果依賴主觀性判斷，溫度和凝集時間也會造成特異度和靈敏度下降[8]。

1.2.3 CT CT用于檢測布魯菌感染后血清的不完全抗體，可作為SAT檢測的補(bǔ)充，多用于慢性感染時進(jìn)行診斷，靈敏度和特異度高，但過程較為復(fù)雜，其中Coombs試驗(CGT)目前最為常用。Borsa等[9]對150例布病患者的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CGT可用于發(fā)現(xiàn)漏檢的RBPT陰性的患者標(biāo)本，且反應(yīng)速度快，可用作快速篩選試驗。

1.2.4 ELISA ELISA主要針對復(fù)雜、慢性病例，尤其是其他實驗陰性但高度疑似的病例。目前，布病的ELISA檢測有間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(IELISA)和競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(CELISA)。Madut等[10]對416例發(fā)熱患者血清采用RBPT、SAT和CELISA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)普通門診的發(fā)熱患者中CELISA檢測的陽性率為23.3%，該方法可用于地區(qū)布病的防控。

1.2.5 Brucellacapt Brucellacapt是基于免疫捕獲-凝集技術(shù)的布病診斷方法，其快速簡單，且靈敏度和特異度高，適合急性期和愈后隨訪，得到了國際認(rèn)可。Peeridogaheh等[11]對11例布魯菌血培養(yǎng)陽性患者的血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Brucellacapt全部呈陽性，靈敏度優(yōu)于ELISA，說明Brucellacapt是在布病流行區(qū)進(jìn)行診斷的有力工具。

1.2.6 CFT CFT通過標(biāo)本內(nèi)抗原抗體復(fù)合物同補(bǔ)體結(jié)合，暴露抗原或抗體進(jìn)行診斷，靈敏度和特異度較高，但操作復(fù)雜，一般不用于常規(guī)檢驗，僅作為確診試驗或用于判斷其他方法難以確診的樣品。Ayala等[12]對116例有布病癥狀但血培養(yǎng)陰性患者的血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CFT陽性檢出率高于IELISA。

1.2.7 ICG ICG是以膠體金為標(biāo)志物標(biāo)記抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，其簡單、快速、準(zhǔn)確、無污染，靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，且用量少，易于進(jìn)行現(xiàn)場檢測。目前，用于布魯菌檢測的主要有膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)。孫華麗等[13]對137例布魯菌感染確診病例和78例非布魯菌感染患者的血清進(jìn)行檢測，GICA的靈敏度和特異度可達(dá)90.51%和93.59%。

1.2.8 FPA FPA通過測定游離抗原與抗原—抗體復(fù)合物分子轉(zhuǎn)動率的不同來檢測相應(yīng)抗體，靈敏度和特異度極高，操作簡單省時，適用于不同樣品的檢測，能用便攜設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)。Lucero等[14]對587例患者血清使用FPA進(jìn)行了檢測，特異度和靈敏度較高，且測試相對便宜。

1.3 分子生物學(xué)方法 分子生物學(xué)方法安全有效，簡單快速，靈敏度高，特異度好，樣品需求量少。目前，用于布魯菌檢測的分子生物學(xué)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等。

1.3.1 PCR PCR技術(shù)于1996年首次被應(yīng)用于布病的診斷中[15]，微量高效，特異度和靈敏度高，對樣本的種類和純度沒有特殊要求，能鑒別疫苗株和野毒株。Mohseni等[16]對100份疑似患者的血清標(biāo)本使用ELISA、PCR和SAT進(jìn)行了檢測，其中50份SAT檢測呈陽性，45份PCR呈陽性，提出同時使用血清學(xué)和分子技術(shù)可克服檢測的限制。

1.3.2 LAMP LAMP是一項恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，特異度強(qiáng)，靈敏度高于普通PCR，操作簡單迅速高效，無需特殊設(shè)備，結(jié)果能用肉眼觀察，更適合布病流調(diào)現(xiàn)場或基層衛(wèi)生防疫[17]。Trangoni等[18]對布魯菌進(jìn)行LAMP檢測，表明其靈敏度與PCR一致，并可對所有生物型進(jìn)行鑒定，有助于縮短在配置較低的實驗室中進(jìn)行檢測的時間。

1.3.3 MALDI-TOF-MS ALDI-TOF-MS是通過質(zhì)譜指紋圖進(jìn)行細(xì)菌鑒定的技術(shù)，靈敏度高，操作快速準(zhǔn)確，是目前公認(rèn)的診斷方法，但操作復(fù)雜，用時長，必須依賴已知菌株的譜庫。Ferreira等[19]對131例臨床分離布魯菌進(jìn)行鑒定，屬間鑒定準(zhǔn)確度達(dá)100%，并可直接使用血培養(yǎng)瓶中的樣品。

2 布魯菌的分子生物學(xué)分型方法

細(xì)菌分型對于布病的流行病學(xué)監(jiān)控，以及研究布魯菌的致病機(jī)制和耐藥性監(jiān)測具有重要意義。傳統(tǒng)分型方法操作繁瑣，無法鑒定部分非典型菌株，難以滿足布病防控的需要。分子生物學(xué)分型靈敏度、特異度、重復(fù)性更佳，更適合快速分型和溯源分析。常用的布魯菌分子生物學(xué)分型方法包括PCR、脈沖場凝膠電泳技術(shù)(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)、高變量八聚物寡核苷酸指紋分析(HOOF-Prints)等。

2.1 PCR 目前，有多種PCR方法用于布魯菌的分型，布魯菌多重PCR(AMOS-PCR)就是一種，其快速簡便，應(yīng)用價值較強(qiáng)，與傳統(tǒng)分型方法一致性達(dá)100%，與其他無關(guān)細(xì)菌無交叉反應(yīng)。1994年Bricker等[20]首次將AMOS-PCR應(yīng)用于布魯菌分型。王月等[21]對12株布魯菌進(jìn)行分型，PCR方法與傳統(tǒng)方法結(jié)果一致，并可確定當(dāng)?shù)馗腥镜闹饕獎游飩魅驹础?/p>

2.2 PFGE PFGE是進(jìn)行脈沖場電泳從而得到DNA圖譜的分型技術(shù)，鑒別能力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，分辨率高。趙嘉詠等[22]通過PFGE技術(shù)將20株布魯菌進(jìn)行分型，得出其分別屬于不同的族群和帶型，為布魯菌病原學(xué)研究積累了分子基線數(shù)據(jù)。但該技術(shù)費時費力，且對操作人員有一定技術(shù)要求。

2.3 MLST MLST通過對多個管家基因進(jìn)行測序，利用核苷酸序列變異鑒定細(xì)菌型別，將布魯菌分為不同的序列型(STs)，重復(fù)性好，分辨率高，但費用較高。Shome等[23]對27株布魯菌進(jìn)行了MLST分型，顯示這些菌株屬于5種不同的STs；MLST可有效對野毒株和標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的關(guān)系進(jìn)行分析，并為臨床分型和預(yù)防接種提供依據(jù)。

2.4 MLVA MLVA是根據(jù)細(xì)菌同源重復(fù)序列數(shù)目差異設(shè)計的分型方法，能鑒定傳統(tǒng)方法無法分型的布魯菌，分辨率高，重復(fù)性好，可用于傳染源的查找和國際間菌株的比較。目前，應(yīng)用于布魯菌分型方法的主要有MLVA-8、MLVA-11和MLVA-16[24]。Sun等[25]對59株布魯菌進(jìn)行MLVA和MSLT分析，發(fā)現(xiàn)這兩種方法有助于了解疾病的傳播和傳染源的檢測。

2.5 HOOF-Prints HOOF-Prints主要針對布魯菌基因組中八聚物片段AGGGCAGT的重復(fù)數(shù)目不同而進(jìn)行分型[26]，分辨率高，重復(fù)性好，能將傳統(tǒng)分型方法不能分型的非典型菌株進(jìn)行分型。劉志國等[27]對83株布魯菌采用HOOF-Prints方法進(jìn)行基因分型，重復(fù)性較好，證實在布魯菌疫情爆發(fā)時HOOF-Prints是進(jìn)行流行病學(xué)分析的有效補(bǔ)充手段。

綜上所述，近年我國布魯菌的感染率逐年上升，在積極防治的同時，準(zhǔn)確診斷和分型也成為研究者積極探索的方向。但目前并沒有一種技術(shù)能同時滿足低成本、高分辨率、高靈敏度、高特異度、分型能力強(qiáng)、重復(fù)性好、易推廣等諸多特點，相信不久能研究出更理想的方法，為布病的診治、流行趨勢的掌控，人畜間布病防控提供強(qiáng)有力的支撐。